工艺参数对高水分组织化大豆蛋白产品特性及结构的影响

梁春艳，张一凡，单秀峰，杜思琦， 朱旻鹏，肖志刚

（1.沈阳师范大学 粮食学院，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳师范大学 实验教学中心，辽宁 沈阳 110034）

组织化植物蛋白具有良好的色泽，类似动物肉的纤维结构和咀嚼感，可作为动物肉的部分替代品改善产品营养，降低生产成本[1-2]。高水分挤压技术在低水分技术基础上发展形成，是指在原料水分含量较高[3]（40%以上）的条件下，在温度、剪切、压力等物理场作用下，蛋白质分子发生变性、分子链取向、重新交联后产生纤维状结构，生产出组织化植物蛋白产品的技术[4]，其优点为效率高、成本低、无化学污染，经挤压处理后的产品具有消化吸收率高、营养素损失少、货架期长等特点[5]，产品无需复水，且在外观、口感及组织形态上与动物肉更为接近。挤压加工参数及物料水分等工艺条件对组织化蛋白的色泽、质构特性等有显著影响。采用单因素试验，以高水分组织化大豆蛋白加工工艺参数（挤压温度、螺杆转速、喂料速度、冷却温度、水分含量），对产品色泽、质构等的影响进行了研究，为高水分组织化大豆蛋白的高效生产提供了理论指导和技术支撑。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（蛋白含量87.94%），山东禹王生态食业有限公司提供；十二烷基硫酸钠（SDS），大连美仑生物技术有限公司提供；尿素（Urea）、Folin酚甲试剂A、Folin 酚甲试剂B、Folin 酚乙试剂，北京索莱宝科技有限公司提供；2-巯基乙醇（2-ME），上海麦克林生化科技有限公司提供。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

双螺杆挤压机，济南赛信机械有限公司产品；CT3 型质构仪，美国Brookfield 公司产品；CR-400型色差仪，柯尼卡美能达公司产品；Scientz-12N 型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；SKD-200 型凯氏定氮仪，上海沛欧分析仪器有限公司产品；DR-3000 型系列酶标分析仪，无锡华卫德朗仪器有限公司产品；Anti J-E 型高速离心机，贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司产品；S4800 型扫描电子显微镜，日本日立公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验设计

挤压温度主要是指挤压机蒸煮区的机筒温度，5 段控温前4 段双螺杆挤压机各段由进料端至出料端的温度设置分别为80，80，120，130 ℃。以大豆分离蛋白为原料，挤压温度、螺杆转速、水分含量、冷却温度、喂料速度为单因素进行试验，控制其他因素不变，分别考查挤压参数对组织化蛋白色泽、质构、组织化度的影响。挤压工艺参数设置为出料端挤压温度150 ℃，螺杆转速280 r/min，喂料速度6 kg/h，冷却温度55 ℃，水分含量70%。

挤压工艺单因素试验时，各因素水平设置如下：出料端挤压温度为130，140，150，160 ℃；螺杆转速240，260，280，300 r/min；喂料速度5.5，6.0，6.5，7.0 kg/h；冷却温度45，50，55，60 ℃；物料水分含量64%，67%，70%，73%。

1.3.2 组织化大豆蛋白色泽测定

色泽采用色差仪测定，对采集完样品的5 个不同部位测定色泽，取平均值，应用L*，a*，b*表色系。L*为明度指数，值越大表明被测物越白亮。a*和b*值为彩度指数，a*值为正值表示偏红，负值表示偏绿；b*值为正值表示偏黄，负值表示偏蓝，绝对值越大表示偏向越严重。ΔE 表示产品与白色板的色差，值越大表示与白色板的差别越大[6]。

式中：L*s——标准白色板的测定值93.61；

a*s——标准白色板的测定值0.04；

b*s——标准白色板的测定值3.79。

1.3.3 组织化度测定剪切功和组织化度测定样品形状示意图见图1。

图1 剪切功和组织化度测定样品形状示意图

质构仪的操作参数为剪切模式，探头NONE，夹具TA-SBA，测试前速度1.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，测试后速度1.0 mm/s，剪切程度75%。每个样品重复测定5 次，去掉2 个最大值和最小值，取平均值。剪切功由质量单位mJ 表示，采用垂直于挤出方向与平行于挤出方向的剪切力做功的比值定量表征产品纤维化程度的大小，即组织化度。

1.3.4 质构测定

取硬度、弹性和咀嚼度等3 个指标反映挤出物的质构特性。测定样品裁剪为边长25 mm 的正方形。质构仪的操作参数为TPA 模式，探头TA7，测试前速度1.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，测试后速度1.0 mm/s，下压程度10%。每个样品测量5 次，取平均值。

1.3.5 蛋白质溶解度

（1）浸提溶剂准备。①0.01 mol/L pH 值7.6，磷酸盐缓冲液（P）；②pH 值7.6，P+8 mol/L Urea 溶解液；③pH 值7.6，P+0.1 mol/L 2-ME 溶解液；④pH值7.6，P+1.5%（m/V）SDS 溶解液。

（2）样品浸提与稀释。不同工艺参数下的挤压样品，在冷冻干燥后粉碎，过80 目筛。取粉状样品0.25 g（精确至0.1 mg）于25 mL 烧杯中，分别加入10 mL 上述4 种溶剂，常温下搅拌浸提2 h 后，重复浸提2 次，离心。取0.05 mL 上清液，加入去离子水0.95 mL 于离心管中，将其稀释20 倍，混匀（摇床160 r/min，1 h）。加20 μL 到96 孔酶标板的样品孔中，采用Lowery 法测得（测定波长650 nm）上清液中可溶性蛋白含量，挤出样品中总的蛋白质含量采用凯氏定氮法测定。

根据张金闯和Liu Y 等人[4-5]的方法，由在不同溶液中的溶解度计算各种化学键交联：（1）天然状态蛋白，①；（2）氢键，②-①；（3）二硫键，③-①；（4）疏水相互作用，④-①。

1.3.6 扫描电镜观察

将冷冻干燥后的挤压样品，沿着挤出方向横切和纵切，并将切片固定在样品台上，进行喷金处理后，并使用场发射扫描电子显微镜在2 kV 电子束操作下分析，放大30，300，500，1 500 倍观察并拍照。

1.3.7 数据处理

采用SPSS（18.0）、Origin（2018）和Office Excel 软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 工艺参数对组织化蛋白产品色泽的影响研究

工艺参数对组织化大豆蛋白色泽的影响见表1。

表1 工艺参数对组织化大豆蛋白色泽的影响

颜色在一定程度上反映了蛋白挤压组织化过程中化学反应的程度[7]。由表1 可知，随挤压温度的升高，产品明度L*值在150℃时最好，温度继续升高，L*值降低，色泽加深，红色度a*值先上升后下降，ΔE 值在150 ℃时最小，螺杆转速、水分含量的增大，明度L*值先增大后减小，冷却温度升高，L*值减小，a*值先增大后减小，ΔE 值增大。温度和水分是影响色泽的主要因素，较高的温度使蛋白美拉德反应加剧，产生类黑色素等物质，色泽也随之加深，从而使产品颜色加深，水分不仅起塑化剂的作用，还使产品黏度降低，形成适当的熔融体，较高的含水量降低了美拉德反应的速率，获得人们可接受的色泽。

2.2 工艺参数对组织化蛋白产品组织化度的影响

工艺参数对组织化大豆蛋白组织化度的影响见图2。

图2 工艺参数对组织化大豆蛋白组织化度的影响

由图2 可知，随着挤压温度、螺杆转速、喂料速度的增大，组织化度先升高后降低，物料水分的提高促进组织化度提高，可能是因为在较高水分环境中，天然状态下呈球状的大豆蛋白分子结构能够更容易和更充分沿流动方向发生线性伸展[8]，从而使挤出物表现出更充分的组织化状态，但水分含量在70%以上时，组织化度显著下降，N Kitabatake 等人[9]发现，在70%湿度挤出物松散无定形，在80%的湿度下，蛋白质变性似乎是不完整的[10]。冷却温度使充分冷却，蛋白与蛋白相互作用增大，层流结构相互交联，促进稳定取向和交联结构，在55，60 ℃较好[11]，温度过低不利于纤维结构形成与定性。

2.3 工艺参数对组织化蛋白产品质构特性的影响

工艺参数对组织化大豆蛋白质构特性的影响见表2。

表2 工艺参数对组织化大豆蛋白质构特性的影响

由表2 可知，随着挤压温度的升高，产品的硬度和咀嚼性先增加后减小，随螺杆转速、喂料速度、冷却温度的升高，硬度和咀嚼性先降低后升高，随着物料水分含量升高，硬度和咀嚼性降低，挤压操作参数对弹性影响不大。随着水分含量的增大，在物料和水的作用下，使产品硬度变软，咀嚼性降低，可能导致不完整的组织化过程和较软的组织[12]。Fujioy H N 等人[13]发现，自由水在展开的大豆蛋白分子之间起润滑剂作用并填充到产品骨架中使挤压产品更易取向物料浓度变稀，从而使挤出产品组织化度、硬度和咀嚼度变小。

2.4 工艺参数对组织化蛋白产品结构的影响

工艺参数对组织化大豆蛋白结构的影响见表3。

表3 工艺参数对组织化大豆蛋白结构的影响

由表3 可知，随着挤压温度和水含量的升高，蛋白的氢键作用力先升高后降低，喂料速度增大，氢键先降低后升高，冷却温度增大，氢键作用力下降。二硫键的作用力随挤压温度和水分含量的升高，先升高后降低，喂料速度升高，二硫键先降低后升高，螺杆转速和冷却温度升高，二硫键降低，在组织化过程中，蛋白质分子内原有的二硫键可能发生了少量的断裂，并且高温可能会加速该反应的进行[14]。挤压温度、螺杆转速和水分含量升高，疏水作用先升高后降低，喂料速度增大，疏水作用先减小后增大，冷却温度增大，疏水作用升高。螺杆转速提高，大豆蛋白熔融变性重组后疏水作用均增加，产品中以氢键和疏水作用的非共价键结合的大豆蛋白溶解度迅速增加[12]，但转速过大时，物料之间摩擦变大，由于产品在机筒内停留时间较短，氢键和疏水作用随之减小，蛋白挤压变形重组后的蛋白链在温度冷却段可能遭到破坏，冷却温度升高，组织化大豆蛋白中，由于蛋白混合充分，更多分子链的展开，更多的疏水基团暴露[15]，疏水作用增大。在整个挤压过程中，非共价键对维持蛋白构象的贡献最大，其次是共价键的影响，与之前[4，14]的报道一致。

2.5 扫描电镜观察

挤压产品显微结构对比见图3。

图3 挤压产品显微结构对比

选用2 种不同组织化度的组织化大豆蛋白样品A（组织化度0.67），B（组织化度1.17），用扫描电镜对样品的横、纵向切面进行观察。

由图3 可知，显微结构下，（A1～A4，B1～B4，A5～A8，B5～B8 的放大倍数分别为30，300，500，1 500 倍），从横切面来看，组织化度高的样品B 比组织化低的样品A 结构更紧密，孔隙结构的数量更多，但孔径更小。由纵向切面可以看到，样品B 有着更紧凑和更平滑的层状结构排列，层状结构明显。充分混合和剪切力的作用下，大豆蛋白形成熔融态，表现出一定的胶凝性和成膜性，局部形成膜状气腔[16]，但其形成的纤维结构比较粗，纤维结构不明显，孔隙比较多，结构不紧密，从横向和纵向可以看出在冷却过程中组织化蛋白实现了水相和蛋白相之间的分离，形成纤维结构。

3 结论

随着挤压温度的增大，产品硬度、咀嚼性先升高后降低，颜色加深，非共价键作用力增强后减弱，二硫键减弱；物料含水率增加，产品硬度、咀嚼性先升高后降低，色泽变浅，氢键、二硫键、疏水作用先增强后减弱；螺杆转速增加，产品的明度先增加后减少，硬度、弹性、咀嚼性先减少后增加，蛋白质主要以疏水作用力为主；固体喂料量增加，产品硬度、弹性、咀嚼性和相互作用力均先升后降；冷却温度升高，产品的硬度、弹性、咀嚼性先减少后增加。为优化高水分大豆蛋白参数，提供了有效的工艺参数理论依据，也为在食品领域的应用提供了可靠的技术支撑和理论指导。