微小RNA-21对缺氧人脐静脉内皮细胞 凋亡的影响

许耀文 孙国通 刘双梅

作者单位：266011 山东青岛，青岛市市立医院本部心内一科（许耀文）

262700 山东寿光，寿光市中医医院心血管病科（孙国通）

266071 山东青岛，青岛市市立医院东院区干部保健科（刘双梅）

微小RNA（microRNA，miR）是一类长度为18～ 25个碱基的小分子单链非编码RNA，在生物体内高度保守，具有基因调节作用，可通过特异性识别靶mRNA的3'非 编 码 区（3'-untranslation region，3'-UTR）抑制靶mRNA的蛋白表达或直接降解靶mRNA，调节机体蛋白质水平，人类约30%的基因受到miR的调节［1］。有研究表明，miR-21在心血管系统中存在高表达，可参与调节血管平滑肌、心肌细胞等的增殖、分化和凋亡［2］。心肌缺氧缺血导致的细胞凋亡是心脏缺血性疾病的本质，因此减少心肌细胞的凋亡与坏死，增加细胞存活数量，是降低冠心病病死率的根本。其中心肌梗死（actue myocardial infarction，AMI）对心肌细胞的损伤最严重，其病死率逐年上升，患者预后较差［3］。因此在心肌缺血后及早通畅血流，对心肌组织的恢复有关键作用。近年来，缺氧缺血性疾病的发病机制需要进一步探讨，miR-21是否参与调控缺氧过程尚未清楚，明确其发病机制后，才能进一步减少由缺血损伤导致的心肌细胞死亡。本研究在人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）缺氧后，以及转染miR-21抑制剂后观察细胞凋亡情况，进一步探讨miR-21在缺氧细胞凋亡中的作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 HUVEC购自江苏省江阴齐氏生物科技有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，反转录和实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，引物设计合成于广州复能基因有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司，青霉素和链霉素双抗购自默克Sigma公司。MGC AnaeroPack系列缺氧试剂盒及指示剂均购自日本三菱瓦斯化学系式会社，miR-21抑制剂和阴性对照品均购自上海吉玛公司，流式细胞术凋亡试剂盒购于上海七海复泰生物科技有限公司。

1.2 细胞培养 使用DMEM高糖培养基（含10% FBS和双抗）培养原代细胞，当细胞融合80%～90%时进行胰酶消化传代培养，隔日换液。传代细胞数量足够多且培养至细胞融合80%～90%时，将细胞按相同浓度接种到6孔培养板上，每瓶细胞数量约5×105个/孔。正常环境下培养细胞1 d，至细胞稳定并贴壁后，进行后续实验。

1.3 缺氧处理 使用厌氧盒及厌氧产气袋进行缺氧处理。模型建立前先进行细胞培养，待细胞贴壁后换液，立刻放入缺氧盒内，缺氧盒内加入一次性缺氧料和缺氧指示条（缺氧料可吸收O2，产生CO2），并立即密闭盒盖，置于细胞培养箱进行缺氧培养。厌氧指示条为粉色时提示盒中为无氧状态，此刻开始计时。分别给予细胞不同时间的缺氧刺激，到时间后取细胞进行后续实验。

1.4 研究分组 将培养的HUVEC分为6组，分别为正常对照组、缺氧6 h、12 h、24 h组、转染miR-21抑制剂+缺氧24 h组、阴性转染+缺氧24 h组，每组3个复孔。实验结束后收集各组细胞进行相应检测。本研究方案通过青岛市市立医院伦理学委员会批准（审批号：2021-032）。

1.5 检测各组细胞miR-21表达 收集各组细胞，采用离心柱法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA后保存于-20 ℃冰箱，检测miR-21水平，以内参基因U6作为标准。PCR反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。采用Δ循环阈值法，计算相对表达量即2-ΔΔCt。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，重新悬浮于结合缓冲液，加入荧光标记的Annexin V和PI试剂，避光孵育15 min，30 min内通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

1.7 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件录入和分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常HUVEC和缺氧HUVEC的形态学观察 正常HUVEC可见细胞贴壁生长，为扁平多角形，边界清楚，细胞质丰富；细胞核为圆形或椭圆形，核内染色质稀疏空亮。缺氧状态下HUVEC呈长梭形改变，并出现水肿及破裂。见图1。

图1 正常HUVEC（1A）和缺氧HUVEC（2B）的细胞形态学观察

2.2 细胞miR-21表达分析 以正常对照组miR-21 表达量为1，缺氧处理6 h、12 h、24 h组细胞的相对表达量均明显低于正常对照组（均P＜0.05）。见图2。

图2 正常对照组与缺氧不同时间组的miR-21相对表达量

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 缺氧6 h、12 h、24 h 组的细胞凋亡率均明显高于正常对照组（均P＜0.05）。转染miR-21抑制剂+缺氧 24 h组的细胞凋亡率最高，为（16.1±1.34）%，明显高于缺氧24 h组（P＜0.05）；阴 性转染+缺氧24 h组的细胞凋亡率与缺氧24 h组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见图3～4。

图3 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

3 讨论

图4 各组细胞凋亡率比较

miR是一类具有调控作用的内源性非编码小分子RNA，在人类30%～40%的蛋白表达过程中都参与调节［2］。其中，miR-21在心血管系统中广泛表达，尤其在缺血性疾病（如冠心病、缺血性肾病、肺动脉高压等）患者体内的表达水平有明显变化［4］。然而，关于miR-21在HUVEC缺氧损伤过程中的表达变化尚未有报道。

近年来研究表明，miR-21是一种具有抗凋亡作用的RNA。在多种肿瘤细胞中，miR-21都发挥了明显的抗凋亡作用。Kulshreshtha等［5］研究表明，miR-21表达在部分乳腺癌患者中上调。赵守香等［6］也发现miR-21通过负性调控人乳腺癌细胞中STAT3基因的表达，抑制癌细胞侵袭。Mace等［7］研究表明，胰腺癌患者癌细胞内缺氧可介导miR-21的表达，通过缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表达上调，使细胞避免了由于缺氧环境导致的凋亡。Cheng等［8］在缺血再灌注实验中发现，miR-21的表达降低可增加心肌细胞的凋亡。Yin等［9］向大鼠体内注入化学合成的miR-21 类似物，结果显示大鼠的心肌细胞凋亡数量减少。然而，如果注入miR-21抑制物，则miR-21介导的保护作用消失。在大鼠心肌缺血后，随着再灌注时间延长，凋亡细胞数量增多，因此过表达miR-21可减少细胞凋亡数量，提示miR-21可抑制细胞凋亡［10］。

本研究对体外培养的HUVEC以及转染miR-21 抑制剂的HUVEC分别给予缺氧6 h、12 h、24 h的刺激，记录各组miR-21表达水平的变化，并用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。本研究结果显示，缺氧6 h、12 h、24 h的HUVEC中miR-21表达均下调，表明miR-21参与缺氧过程中内皮细胞的凋亡过程。流式细胞术结果也显示，随着缺氧时间延长，细胞凋亡率明显升高。转染miR-21抑制剂的细胞凋亡率明显增高，与阴性转染组比较有明显差异，这都表明miR-21参与缺氧对内皮细胞损伤的过程，降低miR-21可能是缺氧促进细胞凋亡的机制之一，因此miR-21具有抗凋亡的作用。

miR-21在缺氧性心肌细胞损伤过程中可能通过抑制靶基因介导细胞凋亡的关键因子〔程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）〕发挥抗细胞凋亡的作用［11］。PDCD4在细胞凋亡启动后表达上调，是介导细胞凋亡的关键因子［12］。Bcl-2是另一种与缺血性心脏疾病导致凋亡有关的基因，可发挥抑制细胞凋亡的作用。Bcl-2/Bax决定细胞是否进入凋亡途径，当其比值降低时，细胞发生凋亡，caspase-3是此过程的执行者［13-14］。

综上所述，本研究结果显示，miR-21在HUVEC凋亡中发挥重要的抗凋亡作用，且对内皮细胞具有调控作用，也为改善内皮细胞功能，控制动脉硬化性疾病提供了新的治疗方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突