多房棘球绦虫多表位疫苗GILE的设计构建及原核表达※

周 培，辛明远，马敬为，胡缤文，王 蕾，魏 威，冯 琳，周 振，刘文婧，李润乐，汤 锋

(1.青海大学高原医学研究中心，青海省高原医学应用基础重点实验室，青海 西宁 810001；2.青海大学研究生院，青海 西宁 810001；3.青海大学基础医学部，青海 西宁 810016)

目前尚未发现单一的抗原可以有效预防泡型包虫病(Alveolar Echinococcosis，AE)，找到一种可以诱导机体对各阶段多房棘球绦虫产生免疫应答的抗原肽是研制AE疫苗亟需解决的问题。故本研究在课题组前期研究(多房棘球绦虫EmEMY162、EmLAP的优势抗原表位鉴定)的基础上，设计、构建多房棘球绦虫多表位疫苗GILE，并表达、纯化该重组蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

pCzn1质粒(钟鼎生物公司)，Artic express表达菌株(钟鼎生物公司)，限制性内切酶(TaKaRa公司)，蛋白质Marker(Thermo公司)，IPTG(Biotopped公司)，氨苄青霉素钠(Solarbio公司)，透析袋(Ruitaibio公司)，Ni-NTA亲和层析柱(GenScript公司)，4×蛋白上样缓冲液(Solarbio公司)，鼠抗His抗体(Boster公司)，羊抗鼠IgG抗体(abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 GILE结构预测

据课题组前期研究成果及相关文献[1-4]，选取多房棘球绦虫优势抗原表位。将各优势抗原表位相串联，构建多表位疫苗GILE。通过SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)、pyMOL(https：//pymol.org/2/)软件对不同的多表位疫苗(优势抗原表位连接顺序不同)进行同源建模，选取其中最适合诱导免疫应答的优势抗原表位连接顺序，以选取的连接顺序为模板构建多房棘球蚴多表位疫苗GILE。通过SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)软件对设计的多表位疫苗GILE进行二级结构预测，初步评估多表位疫苗的免疫原性。通过VMD软件分析多表位疫苗GILE的亲水性，为后续GILE的表达、纯化提供依据。

1.2.2 GILE基因序列合成和重组质粒pCzn1-GILE构建

选择在结构预测中未产生其他抗原表位且各表位间无相互影响的模型为模板构建GILE。确定模板后，采用PCR-based Accurate Synthesis的方法设计全长拼接引物，在引物的两端设计保护性碱基，合成基因GILE。将合成的GILE基因连入载体pCzn1的NdeI和XbaI位点之间，构建重组质粒pCzn1-GILE。通过酶切和基因测序法对重组质粒pCzn1-GILE进行验证。

1.2.3 重组表达菌的构建及重组蛋白表达部位鉴定

将重组质粒pCzn1-GILE转化入大肠杆菌表达菌株Artic express中，构建重组表达菌。将重组表达菌的菌液涂布于含有Ampicillin(50μg/mL)的LB平板上，在培养箱(37℃)中过夜培养，筛选阳性菌株。次日，选取阳性单克隆菌落接种于5 mL含Ampicillin的LB液体培养基中，恒温振荡(37℃，220r/min)，过夜培养后，按1：100接种于50 mL含Ampicillin的LB液体培养基中继续振荡培养(37℃，220r/min)。当菌液生长至对数期，取1 mL菌液离心，分离菌液上清、沉淀，分别加入4×蛋白上样缓冲液混悬后作为阴性对照。其余菌液中加入IPTG(0.5mM)，低温振荡培养(11℃，220r/min)，过夜诱导GILE重组蛋白的表达。然后，通过12%SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色法确定GILE的表达部位。

1.2.4 GILE蛋白纯化及鉴定

参照文献方法[5]，将过夜诱导的菌液离心(10000r/min，4℃，3min)，收集菌体沉淀，沉淀重悬于Binding Buffer中，在冰上超声破碎(破碎3s，间隔7s，功率为60%)30 min。将破碎后的菌液离心(10000r/min，4℃，3min)，收集菌体沉淀，并加入8 M的尿素进行蛋白变性。继续超声破碎(破碎3s，间隔7s，功率为60%)20 min。离心后将上清加入透析袋中，置于含有还原型GSH和氧化型GSSH的蛋白复性缓冲溶液中，在4 ℃低温条件下进行复性。复性完成后，通过低压层析系统进行重组蛋白的Ni柱亲和纯化。用Binding Buffer冲洗(恒流泵流速设置为25)Ni-NTA柱至OD280值为0，将蛋白样品加入Ni-NTA柱(恒流泵流速设置为20)。上样15 mL后，用Washing Buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaH2PO4，60mM咪唑，pH=8.0)洗脱杂蛋白。然后用Elution Buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaH2PO4，250mM咪唑，pH=8.0)洗脱并收集GILE蛋白。将洗脱收集的溶液加入透析袋中，通过吸收法(PEG20000)进行浓缩，直到溶液浓缩至淡黄色。用BCA试剂盒检测蛋白浓度，通过12%SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。

用Western blotting法进一步验证重组蛋白表达情况。将上述分离纯化的重组蛋白电泳后，转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭(4℃，过夜)。次日，使用TBST洗涤后，加入一抗(鼠抗His抗体)孵育(室温)1 h，使用TBST洗涤，加入二抗(羊抗鼠IgG)孵育(室温)1 h。使用TBST洗净PVDF膜，在显影仪下观察蛋白表达情况。

2 结果

2.1 多表位疫苗GILE的结构设计

多房棘球绦虫EmGLUT1、EmLAP、EmEMY162优势抗原表位氨基酸序列及类型见表1。通过SWISS-MODEL软件对不同连接顺序构建的多表位疫苗进行同源结构建模并对比，结果如图1所示，各模型的表位连接顺序为LAP464-479―LAP495-510―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410―LAP504-518―EMY162106-121；(图1.A)EMY162106-121―LAP464-479―LAP495-510―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410―LAP504-518；(图1.B)LAP495-510―EMY162106-121―LAP464-479―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410―LAP504-518；(图1.C)LAP464-479―LAP495-510―EMY162106-121―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410―LAP504-518；(图1.D)LAP504-518―LAP464-479―LAP495-510―EMY162106-121―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410；(图1.E)EMY16295-104―LAP464-479―LAP495-510―LAP396-410―LAP396-410―LAP504-518―EMY162112-126(图1.F)。结果表明，仅图1.F舒展性良好，且各抗原表位间无相互掩盖和干扰，其余模型表位间有干扰。因此，选择图1.F的表位连接顺序构建多表位疫苗GILE。通过SOPMA软件对设计的多表位疫苗GILE进行二级结构预测，结果表明，二级结构中β折叠和无规则卷曲结构占比较大，表明该重组蛋白质可能具有较好的免疫原性。如图2所示，α螺旋占13.84%，β折叠占26.25%，β转角占14.88%，无规卷曲占45.82%。通过VMD软件分析多表位疫苗GILE的亲水性，如图3所示，图中蓝色表示亲水性残基，红色表示疏水性残基，结果表明，GILE是亲水蛋白。

表1 合成多表位疫苗的各种抗原表位氨基酸序列及类型

图1 GILE蛋白结构同源建模

图2 GILE二级结构预测图

图3 GILE亲—疏水性图

2.2 重组质粒pCzn1-GILE的酶切及测序鉴定结果

重组质粒pCzn1-GILE经过酶切后进行电泳，酶切位点为CATATG、TCTAGA。结果如图4.A所示，相比于酶切前质粒，酶切后电泳结果在1266 bp左右处出现了清晰明亮的条带，与设计的GILE(1266bp)大小一致，表明GILE目的序列成功插入质粒中，目的质粒构建成功。将重组质粒pCzn1-GILE转入Top10克隆菌株，选取阳性克隆子进行测序。图4.B为部分测序及比对结果，结果和预期序列比对一致，表明目的质粒构建成功。

A：pCzn1-GILE酶切鉴定图(M：Mark；Line1：酶切前质粒；Line2：酶切后质粒)；B：pCzn1-GILE序列比对结果

2.3 重组蛋白GILE表达部位的鉴定与纯化结果

取重组基因工程菌株诱导前、后的菌液上清和沉淀，采用12%SDS-PAGE法进行分析。如图5.A所示，在超声破碎上清、沉淀中，约45 KD处出现明显条带。结果表明，重组蛋白GILE既以可溶性蛋白的形式表达于菌液中，又以包涵体的形式表达于菌体沉淀中。取菌体沉淀超声破碎后加入8 M的尿素进行蛋白变性，继续超声破碎后，取上清于低温下(4℃)进行蛋白复性。完成复性后，经Ni-NTA亲和层析法纯化，收集洗脱液，采用12%SDS-PAGE法鉴定纯化蛋白。结果如图5.B所示，纯化后蛋白在45 KD处有明显单一条带，表明目的蛋白成功表达，达到电泳纯。纯化GILE重组蛋白是通过Ni-NTA亲和层析法，如图5.C所示，以60 mM咪唑洗去杂蛋白后得到的重组蛋白的纯度最高，最终得到纯化的重组蛋白浓度为1007.4 μg/mL。

A：原核表达12%SDS-PAGE分析图；B：GILE蛋白纯化SDS-PAGE分析图

2.4 重组蛋白GILE的免疫印迹检测结果

通过鼠抗His抗体对GILE蛋白进行免疫印迹检测，结果如图6所示，纯化后的GILE蛋白能与His抗体特异结合，未见其他条带，表明经Ni-NTA亲和柱层析获得了重组蛋白。

图6 GILE蛋白Western blotting结果

3 讨论

AE虫卵进入中间宿主体内后，在肠道中孵化并释放出六钩蚴。孵化的六钩蚴穿过肝门静脉和淋巴管到达肝脏，最终在肝脏定居，发育为泡球蚴。多房棘球绦虫在中间宿主体内分别经历了虫卵、六钩蚴、泡球蚴三个发育阶段。在不同的发育阶段，虫体表达的蛋白种类和含量均有差异，这是单一多房棘球绦虫蛋白不能产生良好抗AE效果的原因之一。因此，本课题在前期鉴定多房棘球绦虫EmEMY162、EmLAP、EmGLUT1优势抗原表位的基础上，通过生物信息学方法设计抗AE的多表位疫苗GILE。EmEMY162是一种在多房棘球绦虫入侵中间宿主的过程中发挥关键作用的蛋白，该蛋白表达于多房棘球绦虫整个发育周期[6，7]。因此，以EMY162作为抗原肽可能能诱导机体对各个阶段的多房棘球绦虫产生免疫反应，发挥良好的保护作用。有研究表明，重组EmEMY162对多房棘球绦虫感染的小鼠有显著的保护作用(74.3%)[6]。亮氨酸氨基肽酶(LAP)是一种在多房棘球绦虫营养吸收中发挥作用的蛋白。因此，以EmLAP为抗原肽可能诱导机体产生免疫反应，抑制多房棘球绦虫的营养吸收，从而达到防治AE的目的。有研究表明，在多房棘球绦虫感染的小鼠模型中接种LAP，可显著降低囊泡的数量和大小[2]，表明该蛋白可有效防治AE。葡萄糖转运蛋白(GLUT)是一种在多房棘球绦虫摄取葡萄糖的过程中发挥重要作用的蛋白。多房棘球绦虫包含不同的GLUT基因型(GLUT1、GLUT2)，但只有GLUT1有较高的葡萄糖转运活性[8]。因此，以GLUT1为靶点构建疫苗，可能会抑制多房棘球绦虫对葡萄糖的吸收，影响虫体能量供应，进而起到保护宿主的作用。EmEMY162、EmLAP、EmGLUT1在多房棘球绦虫生存、发育中均发挥重要作用。因此，本研究以上述蛋白的优势抗原表位为基础，构建防治AE的多表位疫苗GILE。

表位疫苗因其具有特异性高、安全性好等优点，成为疫苗研发的新方向[9]。抗原表位是抗原特异性激活宿主免疫应答的最小单位，与完整蛋白质诱导的反应相比，抗原表位可以诱导更直接、更有效的免疫反应。近年来，其在寄生虫感染性的疾病预防中也显示出优势。在铜绿假单胞菌毛疫苗的研制中，分别使用菌毛蛋白受体结合域合成肽和完整的菌毛蛋白免疫小鼠，发现使用合成肽免疫的动物对天然菌毛的抗体滴度显著高于用菌毛蛋白免疫的动物的抗体滴度[10]。我们在前期对EmEMY162、EmLAP的优势抗原表位进行了鉴定。EMY162的Th1型优势抗原表位有EMY16227-13、EMY16236-41、EMY16280-89、EMY162129-139，Th2型优势抗原表位有EMY16236-41、EMY16287-96、EMY16297-106[11]。LAP的Th1型优势抗原表位有LAP79-63、LAP396-410、LAP106-120、LAP396-410、LAP504-518，Th2型优势抗原表位有LAP13-28、LAP495-510、LAP396-410、LAP504-518、LAP313-328，B优势抗原表位有LAP464-479、LAP495-510和LAP313-328[4]。本研究在此基础上，选取其中能够刺激机体产生较强免疫应答和特异性较强的优势抗原表位设计、构建多表位疫苗GILE。

在多表位疫苗的设计、构建中，连接处的序列在提高疫苗结构稳定性等方面发挥重要作用[12]。本研究在各表位连接处引入GS和KK氨基酸序列使各表位间有一定间隔，保持多肽链的空间构象稳定性和抗原表位的特异性，防止表位之间互相干扰，避免在连接处形成新表位，间接提高了蛋白酶的切割效率和抗原呈递效率[13，14]。单个表位分子量小，免疫原性弱，不稳定[15]。因此，在GILE的设计中将各抗原表位重复串联2～3次，以增强重组蛋白的免疫原性与稳定性。各抗原表位串联时需遵循一定的顺序，将T细胞抗原表位放在B细胞抗原表位的前端能最大程度保持抗原表位的免疫原性[13]。因此，本研究将免疫原性较强的EmEMY162的B细胞抗原表位放在末端。完成GILE的设计、构建后，使用生物信息学软件对GILE的结构进行分析。

近年来，分子免疫学技术迅速发展。在疫苗研制中，通过生物信息学软件，可方便、快捷地对重组蛋白进行分析。比如，模拟蛋白的结构，分析蛋白的亲—疏水性，预测蛋白的过敏原性及免疫原性并对蛋白的优势抗原表位进行预测[16]。生物信息学软件的应用极大降低了疫苗研制的时间和经济成本，是目前疫苗研制的重要辅助方法。在本研究中，完成GILE的设计、构建后，结合生物信息学软件对GILE进行分析。SWISS-MODEL显示，GILE的三级结构具有良好的舒展性，各优势抗原表位间无掩盖和干扰。这可能有助于GILE各优势抗原表位与抗原呈递细胞和效应T、B细胞结合，更好地引起免疫应答。SOPMA显示，在GILE的二级结构中，α螺旋占13.84%，β折叠占26.25%，β转角占14.88%，无规则卷曲占45.82%。在蛋白质二级结构中，α螺旋和β折叠的稳定性通过氢键维持，并且主要位于蛋白质的内部。白细胞和抗体主要识别蛋白外部区域的β转角和无规卷曲。GILE二级结构预测结果表明GILE易被白细胞和抗体识别，可能有良好的抗原性，能引起明显的免疫应答。VMD显示，GILE是亲水蛋白。

本研究在前期多房棘球绦虫优势抗原表位鉴定的基础上，通过生物信息学软件设计、构建多房棘球绦虫多表位疫苗GILE，完成了GILE的设计并构建了GILE原核表达系统，成功表达GILE重组蛋白，为后续研究打下了基础。本研究为进一步开发新型AE疫苗提供了理论依据。