NF2、EZR和p53基因甲基化与青海汉族、撒拉族、回族胃癌易感关系※

赵 婧，马 美，刘博学，陈思嫒，孙静薇，苏占海

(青海大学医学院，西宁 810001)

我国胃癌分布呈现区域聚集性特征，青海地区汉族、撒拉族、回族发病率高于东南沿海地区。目前研究结果表明胃癌的发生与抑癌基因APC、p15、p16等的异常甲基化有关[1-3]。青海汉族、撒拉族、回族胃癌高发是否与NF2、EZR和p53甲基化异常相关，本研究采用基因组学法开展相关研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

经青海大学医学院伦理委员会批准，从青海大学附属医院、青海省人民医院、青海红十字医院收集汉族、撒拉族、回族胃癌患者胃癌组织标本各30例组成病例组、健康体检者胃组织标本各20例组成对照组。

1.2 试剂与仪器

DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司，中国)，PCR产物回收试剂盒(上海生工公司，中国)；琼脂糖(上海生工公司，中国)，亚硫酸氢盐(上海生工公司，中国)；恒温水浴锅(江苏金坛公司，中国)，低温冷冻离心机(艾本德生命科学公司，德国)，核酸蛋白浓度检测仪(基因有限公司，美国)，DYY-6C琼脂糖电泳仪(北京六一公司，中国)，凝胶成像仪(耶拿公司，德国)，PCR仪(伯乐生命医学产品有限公司，美国)。

1.3 研究方法

1.3.1 组织DNA提取及浓度、纯度的测定

按照试剂盒说明书称取30 mg组织剪碎于离心管中，加入100 μL GA，用匀浆器匀浆，之后再加入100 μL GA，轻柔吹打使其均匀悬浮，提取组织中的DNA。取1 μL TE滴加于核酸蛋白浓度检测仪进行调零，滴加1 μL DNA样品检测其浓度，并记录A260/A280值，该值在1.8～2.0之间提示DNA纯度较高。

做完电泳(1%琼脂糖凝胶)后在紫外灯下验证DNA的完整性。

1.3.2 DNA修饰

用亚硫酸氢盐修饰DNA。

取DNA样品2 μg于1.5 mL离心管中，加纯水定容至50 μL，每管加入5.5 μL新配制的氢氧化钠溶液(3.0mol/L)进行水浴(42℃，30min)。期间，配制氢醌(10mmol/L)、亚硫酸氢钠(3.6mmol/L)溶液，待水浴结束后，加30 μL氢醌、520 μL亚硫酸氢钠溶液，将离心管以锡箔纸包裹(避光)，颠倒(轻柔)混匀。静置片刻后放入水浴箱(50℃，避光，每管加200μL石蜡油，16h)。

1.3.3 NF2、EZR和p53基因甲基化的检测

采用Methyl Primer Express v1.0软件分析NF2、EZR、p53基因序列。设计引物序列分别为NF2-F 5′-AAG GGA AGT AGA GGG ATT TG-3′，NF2-R 5′-TAA CTA CAA TAA CAA TCA CTC TAA ATA C-3′；ezrin-F 5′-GTT GGT TGT TTT GGG ATT TTT TTT TTT TAG G-3′，ezrin-R 5′-CCC CRA AAA ACA CTC RAC CAA AAA AAT C-3′；p53-F 5′-GTT TTG TTA ATT GGT TAA GAT TTG TTT T-3′，p53-R 5′-TCATAAAACACCACCACACTATATC-3′，产物长度分别为329、228、264 bp。反应体系及反应条件分别见表1、表2。PCR扩增结束后进行电泳(2%琼脂糖凝胶)，用凝胶成像仪拍照并记录结果。按照PCR产物纯化试剂盒操作步骤对产物进行纯化，纯化后的产物与pGM-T载体连接，转入DH5α感受态细胞，每个样品挑取5个阳性克隆送上海生工生物公司测序。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应条件

1.3.4 统计学分析

使用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，结果以相对数n(%)表示，两组或多组资料间比较采用卡方检验或连续性校正进行组间比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 青海汉、撒拉、回族胃癌及正常胃组织NF2基因甲基化结果

亚硫酸氢盐亚克隆测序结果显示，青海汉、撒拉、回族胃癌及正常胃组织中NF2基因的15个CpG岛在少数样本中发生部分甲基化。甲基化判定标准：当某一位点发生甲基化时，经亚硫酸氢盐修饰后该位点的胞嘧啶保持不变，若未发生甲基化则该位点的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。计算青海地区汉、撒拉、回族胃癌组织及正常胃组织中NF2基因的甲基化程度，分别为73.3%、70.0%、80.0%；20.0%、15.0%、15.0%。汉、撒拉、回族正常胃组织中NF2基因的甲基化率均高于其正常组织(P<0.001)。(表3)

表3 青海汉族、回族、撒拉族正常胃组织及胃癌组织NF2基因的甲基化率

青海地区汉、撒拉、回族胃癌组织NF2基因的CpG岛甲基化率两两比较结果显示，上述民族胃癌组织的甲基化率无显著差异性(P>0.05)。(表4)提示NF2甲基化与上述民族无关，不具有特异性。

表4 青海汉族、回族、撒拉族胃癌组织NF2基因的甲基化率

2.2 青海汉、撒拉、回族胃癌及正常胃组织EZR基因甲基化结果

亚硫酸氢盐亚克隆测序结果显示，青海汉、撒拉、回族正常胃组织中的EZR基因未发生甲基化改变，在胃癌组织中的EZR基因发生甲基化改变，甲基化判定标准同前。结果显示，与正常胃组织相比，青海汉、撒拉、回族胃癌组织EZR基因甲基化率存在差异(汉族P为0.007，撒拉族为0.033，回族为0.020)。(表5)比较青海汉、撒拉、回族胃癌EZR甲基化率：三者之间没有差异性。提示EZR甲基化与青海汉、撒拉、回族无关，不具有特异性。(表6)

表5 青海汉族、回族、撒拉族正常胃组织及胃癌组织EZR基因的甲基化率

表6 青海汉族、撒拉族和回族胃癌组织中EZR基因的甲基化率

2.3 青海汉、撒拉、回族胃癌及正常胃组织p53基因甲基化结果

亚硫酸氢盐亚克隆测序结果显示，青海汉、撒拉、回族正常胃组织中的p53基因未发生甲基化改变，胃癌组织中的p53基因发生甲基化改变，甲基化判定标准同前。结果显示，与正常胃组织相比，青海汉、撒拉和回族胃癌组织中p53基因的甲基化率存在差异(汉族P为0.001，撒拉族为0.020，回族小于0.001)。(表7)比较青海汉、撒拉、回族胃癌p53甲基化率：三者之间没有差异性。提示p53的甲基化改变与青海汉、撒拉、回族无关，不具有特异性。(表8)

表7 青海汉族、回族、撒拉族正常胃组织及胃癌组织p53基因的甲基化率

表8 青海汉族、撒拉族和回族胃癌组织中p53基因甲基化程度

3 讨论

胃癌的发生、发展是一个多因素相互作用的过程，牵涉到环境因素、遗传因素和饮食因素等。在分子层面上，胃癌的发生与抑癌基因p15、p16等的异常表达或启动子区域的异常甲基化有关。

基因甲基化是指基因在复制完成后，在甲基转移酶复合体的调节下将S-腺苷甲硫氨酸所携带的甲基转移至CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶特定碳原子上的可逆的生物学过程[4]。是其合成后的表观遗传学修饰方式之一，主要发生在CpG二核苷酸序列聚集的大小为100～1000 bp左右的CpG岛，在机体内以高甲基化、低甲基化和可诱导的去甲基化三种状态存在[5]。其中全基因组的低甲基化和部分基因启动子区域的高甲基化状态可改变基因的结构或使其失活，此与肿瘤的发生相关[6，7]。基因在正常组织中通常呈现非甲基化状态，而在肿瘤组织中则表现出高甲基化或低甲基化状态，此与肿瘤的易感性相关[8]。例如，在卵巢癌、前列腺癌中p15、p16、E-钙黏素的甲基化程度高于正常组织，提高了机体对卵巢癌、前列腺癌的易感性[9，10]；在B淋巴细胞白血病和结肠癌中原癌基因KRas和凋亡抑制蛋白Bcl-2呈现低甲基化状态[11]。有研究显示，AREG基因在超过五分之一的结肠癌组织中的甲基化率低于正常结肠组织[12]。

NF2基因又称神经纤维瘤Ⅱ型基因，是一个抑癌基因，可发生无义突变、反义突变及剪切点突变，上述突变可使其编码产物Merlin蛋白变性，进而使其丧失肿瘤抑制活性[13，14]。有研究表明，NF2基因突变或缺失会导致神经纤维瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、双侧前庭神经瘤、间皮瘤、黑色素瘤和肾透明细胞癌等多种肿瘤的发生[15-19]。而肿瘤相关基因启动子区域的甲基化是其发生突变或缺失的机制之一。有研究发现，在乳腺癌、神经纤维瘤、室管膜瘤等肿瘤中均存在NF2基因突变或缺失，同时NF2基因的甲基化与上述肿瘤的发生也有关[20-22]。NF2位于22号染色体，其编码产物merlin与4.1蛋白家族的其他成员如埃兹蛋白(ezrin)、根蛋白(radxin)、膜突蛋白(moesin)具有相似的结构，不同的是merlin的羧基末端不具有与肌动蛋白(F-actin)相结合的区域，而在其氨基末端存在与actin结合的结构域[23]。此外，merlin蛋白的磷酸化/去磷酸化状态，可由p21激活激酶-2(PAK-2)作用于RhoGTPase激酶蛋白家族成员Rac、Cdc42的下游靶蛋白，或PAK-2被生长因子及其他胞外信号活化而受到调节，进而影响细胞骨架的重组，肿瘤的迁移、侵袭，细胞信号的传导，血管的形成[24]。

EZR基因的编码产物为ezrin，该蛋白在正常胃、肾脏及肠组织中均有表达[25]，常定位于细胞皱褶、细胞伪足、微绒毛、卵裂沟及收缩环[26]，与细胞骨架重组，细胞生存、粘附、迁移及侵袭有关[27]。当细胞粘附、迁移及侵袭能力改变时，可导致肿瘤的发生[28]。ezrin是最早在鸡小肠绒毛上皮细胞中发现的ERM蛋白家族成员，可与RhoGTPase蛋白家族成员结合参与细胞粘附、细胞增殖及细胞骨架重组的调节[29，30]。此外，ezrin与粘附分子功能相似，也参与细胞粘附能力的调节，是与肿瘤侵袭相关的重要因子[31]。

p53基因是管家基因，在细胞增殖、细胞周期等方面发挥调控作用[32]；同时，p53又是一个抑癌基因，它的缺失、突变或产物蛋白的功能的缺失都与许多肿瘤的发生密切相关。此外，p53基因与人类50%的肿瘤有关，其基因甲基化与肿瘤易感有关[33]。

有研究发现乳腺癌组织中NF2基因启动子区域甲基化程度高于正常对照组，且其甲基化程度与乳腺癌的发生具有相关性[20]。在胃癌中发现EZR基因发生甲基化改变[27]，其甲基化程度是否与胃癌发生的易感性相关，尚未被阐明。p53基因作为广谱抑癌基因其突变与多种肿瘤相关，但与NF2的作用机制是否一致尚不明晰。

综上所述，青海地区汉族、撒拉族、回族NF2、EZR和p53基因的甲基化与胃癌易感性有关，但无民族差异性。