刈割频率对天然羊草草原羊草叶钙、铁、锌及氨基酸含量的影响

闫春霞，赵 曼，宝音陶格涛，赵一安，祁 智

（1.内蒙古大学生命科学学院/牧草与特色作物生物学教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特 010010；2.内蒙古大学生态与环境学院，内蒙古呼和浩特 010010；3.张家口市农村合作经济经营管理站，河北张家口 075000）

刈割是通过人为干扰对草地进行利用和管理的方式之一。相对于放牧，刈割可以选择性地移除植物地上部分或全部生物量，适度刈割能够缓解枯草在草地上的积累效应，同时也能抑制草地群落中优势物种的竞争性生长，使得竞争能力差的物种有机会进行繁殖和生长，从而提高草原生态的植物多样性与物种丰富度[1-5]。有学者研究表明，连续刈割群落的多度高于隔年刈割，但群落平均高度、盖度以及地上生物量等都低于隔年刈割[5]。肖红等[6]研究表明，刈割显著降低了羊草和无芒雀麦的地上现存量，在生长季降水少的干旱年份，第2 次刈割会严重抑制羊草和无芒雀麦的再生和碳水化合物的贮藏，建议1年刈割1 次[6]。

羊草（Leymus chinensis）是内蒙古草原广泛分布的优质禾本科牧草，作为一种重要的牧草资源，其富含维生素、矿物质，粗蛋白含量高，适口性良好，产量高，耐践踏，对发展草原畜牧业具有重要的经济和社会意义[7-8]。除作饲草外，羊草根茎穿透侵占能力很强，能形成强大的根网，盘结固持土壤作用很大，是很好的水土保持植物[9]。天然羊草草原是内蒙古的主要草原类型，也是我国北方的天然生态屏障和重要的畜牧业生产基地。在内蒙古的广大牧区，为使牲畜安全过冬，每年都要从天然草原割取大量的牧草以备冬春补饲。由于长期刈割和放牧利用，羊草草原生态系统养分大量输出，群落结构严重失调，草地逐年退化沙化，水土流失加剧，生态环境日益恶化，对我国生态安全造成了严重的威胁[10]。因此，探索更加科学合理的刈割与放牧方式，是解决我国天然羊草草原当前生态环境恶化问题的关键。

Ca、Fe、Zn 是植物生长发育必需的矿物质元素，Ca2+参与维持细胞壁、细胞膜结构的稳定，同时是细胞内重要的第二信使，被钙调素感受并形成复合物后，会结合多种转录因子，进而调控下游靶基因，响应各种非生物和生物胁迫的信号传导以及参与调控生物体的生长发育过程[11-12]。Fe2+/Fe3+能够参与DNA复制[13]、叶绿素生物合成、呼吸、光合作用等过程，同时也是电子传递链等多种酶促反应中的辅助因子[14-15]。Zn2+是RNA 聚合酶、超氧化物歧化酶、乙醇脱氢酶和碳酸酐酶等多种酶的活化剂，参与碳水化合物、脂肪、核酸和蛋白质的合成与代谢[16]。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，在植物体内主要以游离态和结合态存在，结合态指多肽和蛋白质。植物组织中游离氨基酸仅占氨基酸总量的2%左右，但对植物的生长至关重要。游离氨基酸不仅是植物重要的氮源，而且可以维持植物的代谢平衡，能够在干旱、冷害、重金属污染等逆境胁迫下灵敏地响应环境压力，从而保证植物的正常生长[17-18]。

本研究通过对不同刈割频率下天然羊草草原羊草叶中Ca、Fe、Zn 及氨基酸含量的测定与分析，确定刈割是否会对草地内羊草的Ca、Fe、Zn 以及氨基酸含量产生影响，探索天然羊草草原最适合的刈割频率，从而为遏制草原生态环境恶化、保护草原生态安全提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验样地

试验样地位于内蒙古自治区锡林郭勒盟白音锡勒牧场的中国科学院内蒙古草原生态系统定位研究站，地理坐标为43°30′～48°30′N，113°30′～116°42′E。该地区属于温带草原气候，羊草为主要优势种，群落组成为“羊草+大针茅+糙隐子草”[19-21]。

1.2 刈割试验设计

刈割试验于2001年开始，2019年结束，连续19年对样地草原羊草进行不同频率的刈割。试验采用随机区组设计，5 个处理：“000”不刈割（CK）、“101”刈割1年休1年、“110”刈割2年休1年、“111”1年刈割1 次、“222”1年刈割2 次。每个处理4 次重复，重复数分别归类为Block 1、Block 2、Block 3、Block 4，小区面积为10 m×10 m。不同刈割频率试验设计见图1a，试验区实际情况见图1b。不同刈割频率的时间设定和刈割后留茬高度参考鲍雅静等[22]的方法，“101”“110”“111”的刈割时间为每年的8月16日，“222”的刈割时间为每年的6月23日和9月12日，刈割后羊草的留茬高度为6 cm。

图1 刈割试验设计及试验区情况

1.3 取样

2019年7月在干燥无雨天气，6 h 内对不同刈割频率试验小区内的羊草进行集中取样。取样时在每个小区内设置5 个1 m×1 m 的样方，选取株高一致的羊草，齐地面剪取全部地上生长部分。

1.4 Ca、Fe、Zn 含量测定

Ca、Fe、Zn 含量的测定方法参照WANG 等[23]的方法。具体步骤为：（1）如1.3 中所述，将收集到的羊草成苗，每株作为1 个样本。（2）每个样本先用0.5 mmol/L CuSO4·5H2O 清洗3 次，然后用去离子水漂洗3 次。105 ℃杀青30 min，80 ℃烘干至恒重。（3）将样品研磨成粉末并充分混匀，用分析天平称取10 mg（精确到0.000 1 g），记录数据。（4）将样品粉末放入5 mL 离心管，加入3 mL 5% HNO3，涡旋混匀。（5）将样品置于37 ℃摇床内，250 r/min 处理48 h。4 ℃，2 200g，离心30 min，取上清液到2 mL 的离心管中。4 ℃，15 000g，离心30 min，再提取上清液至2 mL 的离心管中，作为待测液备用。（6）利用电感耦合等离子体发射仪（ICP-OES，德国耶拿PQ9000），对待测样品中的Ca、Fe、Zn 含量进行测定。

1.5 氨基酸种类及其含量测定

1.5.1 氨基酸种类

试验测定了不同刈割频率下羊草叶中14 种氨基酸的含量，其名称及缩写见表1。

表1 14 种氨基酸的名称及缩写

为了便于比较及直观分析，按照“000”条件下测定的羊草叶中氨基酸含量的高低，将羊草干物质中氨基酸含量≥0.3 μg/mg 划分为大量氨基酸，含量在0.1～0.3 μg/mg 划分为中量氨基酸，含量＜0.1 μg/mg划分为微量氨基酸。

1.5.2 氨基酸含量测定方法

参照张金林等[24]的方法，具体步骤为：（1）如1.3 中所述，将收集到的羊草成苗，每株作为1 个样本。（2）每个样本先用0.5 mmol/L CuSO4·5H2O 清洗3 次，然后用去离子水漂洗3 次。105 ℃杀青30 min，80 ℃烘干至恒重，将样品研磨成粉末并充分混匀。（3）准确称取10 mg 样品粉末（精确到0.000 1 g），加入1 mL 蒸馏水和1 mL 8%的磺基水杨酸。（4）将样品涡旋振荡15 min，4 ℃，10 000g，离心20 min，取上清液至2 mL 的离心管中，作为待测液备用。（5）用日立L-8900 型全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量。

2 结果与分析

2.1 不同刈割频率对羊草叶中Ca、Fe、Zn 含量的影响

由图2 和表2 可知，与“000”相比，刈割频率为“101”时，羊草叶中Ca 含量提高1.2%，但二者无显著差异（P＞0.05）；刈割频率为“110”“111”“222”时，羊草叶中Ca 含量分别提高了13.6%、21.8%、11.8%，差异显著（P＜0.05）。由图2 可知，与“000”相比，不同刈割频率羊草叶中Fe、Zn 含量差异不显著（P＞0.05）。

表2 不同刈割频率下Ca 含量变化值 单位：%

图2 不同刈割频率羊草叶中Ca、Fe、Zn 含量

2.2 不同刈割频率对羊草叶中氨基酸含量的影响

2.2.1 大量氨基酸含量变化

由图3a 和表3 可知，与“000”相比，刈割频率为“101”“110”的羊草叶中Ala 含量差异不显著（P＞0.05）；刈割频率为“111”和“222”的Ala 含量显著降低（P＜0.05），“111”降低28.8%、“222”降低27.2%。与“000”相比，不同刈割频率羊草叶中Ser 含量均显著降低（P＜0.05），“101”降低35.0%、“110”降低24.0%、“111”降低22.0%、“222”降低33.0%。与“000”相比，刈割频率为“101”“110”“111”的羊草叶中Val 含量差异不显著（P＞0.05）；刈割频率为“222”的Val 含量显著降低，为34.5%（P＜0.05）。

2.2.2 中量氨基酸含量变化

由图3b 和表3 可知，与“000”相比，不同刈割频率羊草叶中Leu 含量均显著增加（P<0.05），“101”增加38.0%、“110”增加44.0%、“111”增加66.0%、“222”增加53.0%。与“000”相比，不同刈割频率羊草叶中Arg 含量均显著增加（P<0.05），“101”增加32.0%、“110”增加36.0%、“111”增加40.0%、“222”增加28.0%。不同刈割频率羊草叶中Phe、His、Lys、Glu 含量差异均不显著（P>0.05）。

2.2.3 微量氨基酸含量变化

由图3c 和表3 可知，与“000”相比，刈割频率为“101”“110”“111”的羊草叶中Cys 含量显著增加（P<0.05），“101”增加49.5%、“110”增加41.9%、“111”增加52.0%；“000”与“222”差异不显著（P>0.05）。

表3 不同刈割频率羊草叶中14 种氨基酸含量变化值 单位：%

图3 不同刈割频率羊草叶中氨基酸含量

与“000”相比，不同刈割频率羊草叶中Tyr 含量显著降低（P<0.05），“101”降低46.0%、“110”降低37.0%、“111”降低34.0%、“222”降低15.0%。与“000”相比，不同刈割频率羊草叶中Ile 含量显著降低（P<0.05），“101”降低19.0%、“110”降低18.0%、“111”降低36.0%、“222”降低37.0%。与“000”相比，不同刈割频率羊草叶中Met 含量显著降低（P<0.05），“101”降低35.0%、“110”降低24.0%、“111”降低29.0%、“222”降低35.0%。不同刈割频率羊草叶中Gly 含量差异不显著（P>0.05）。

2.2.4 14 种氨基酸总量变化

由表4 可知，与“000”相比，“101”“110”“111”刈割频率下的羊草叶中14 种氨基酸总量分别上升了30.95%、40.19%、33.76%；“222”刈割频率下的羊草叶中14 种氨基酸总量下降了99.76%。

表4 不同刈割频率羊草叶中14 种氨基酸总量变化值 单位：%

3 讨论与结论

试验结果表明，与“000”（不刈割）相比，当刈割频率为“101”（刈割1年休1年）时，羊草叶中Ca 含量无显著变化（P>0.05）；而“110”（刈割2年休1年）、“111”（1年刈割1 次）、“222”（1年刈割2 次）这3 种刈割频率下羊草叶中Ca 含量显著增加（P<0.05）。仲延凯等[25-27]研究发现，刈割会促进羊草根、叶中Ca含量增加，这与本研究结果相符。植物补偿生长是造成Ca 含量增加的主要原因，而刈割强度是决定植物补偿生长的一个关键因素。由于刈割后植物的叶面积减少，光合作用以及碳、氮的吸收和同化过程减弱，植物体内的营养物质被动员起来以实现最优化分配[28-29]，根系大量吸收水分、无机盐，通过再生长补偿去除的组织[30-31]，从而导致羊草叶中Ca 含量增加。本研究中，不同刈割频率羊草叶中Fe、Zn 含量差异不显著（P>0.05），这可能是由于刈割处理会促进根系大量吸收水分及无机盐，在此过程中，Ca 与Fe、Zn 产生吸收竞争[32]，从而使得羊草叶中Fe、Zn的积累不明显。

本研究表明，刈割后羊草叶中Leu、Arg、Cys（“222”除外）含量显著增加（P<0.05），Ser、Tyr、Ile、Met 含量显著降低（P<0.05），Ala 含量在“111”和“222”时显著降低（P<0.05），Val 含量在“222”时显著降低（P<0.05），而Phe、His、Lys、Glu 和Gly 的含量变化不大（P>0.05）。张海娜等[33]研究发现，柠条在刈割后的萌蘖株叶和根中Arg、Asp、Ser、Val、Tyr、Phe、His、Pro、Ala、Met 等的含量均有不同程度提高。田灵芝[34]研究发现，刈割-施氮后小黑麦中饲237 草中的Leu、Met 和Lys 含量增加。石蕾等[35]研究发现，通过剪叶处理，兴安落叶松针叶内Ile、Phe 的含量提高，而Asp、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Val 和Leu 的含量均有不同程度的下降。本研究中羊草刈割后氨基酸含量变化与上述研究结果有相同之处，也有一些不符，这可能是由于不同研究中所用的试验材料、刈割方式、试验地生态环境不同导致氨基酸的变化规律不相同。

高等植物生长过程中需要不断利用氨基酸合成蛋白质和其他有机氮化物，因此，游离氨基酸不会在体内过多积累，由于不同氨基酸在植物生长中的作用不同，某种氨基酸含量的提高是植物有机体对其需求增大的一种表现[36]。MATTHEW 等[37]研究发现，Leu 具有信号传导的功能，能够诱导许多逆境胁迫响应基因的表达。本研究中，刈割后羊草叶中Leu 含量上升，推测可能是由于刈割胁迫下，植物体需要促进Leu 合成代谢，提高Leu 水平，进而诱导大量逆境响应基因的表达，使植物启动逆境响应[38]；刈割后羊草叶中Arg 含量上升，这可能是由于刈割后的植物需要大量的氮素进行补偿性生长，而Arg 是氮素的重要储存形态，并且能够合成二胺促进细胞分裂[39]，植物体内Arg 含量提高，进而促进植物的补偿性生长；刈割后羊草叶中Cys 含量上升，可能是由于刈割对植物造成刈割胁迫，使得植物在逆境条件下，需要启动叶片内抗氧化系统及其防御机制，而Cys 在植物抗氧化以及氧化还原反应的调控中起着重要的作用[40]，刈割后羊草叶中Cys 含量提高，以响应逆境胁迫。

有研究表明，植物能承受的刈割强度是有一定限度的，如果刈割强度达到植物能维持正常生长的极限，植物表现出等补偿生长[41]。本研究发现，与“000”相比，刈割频率为“101”时，羊草叶中Ca 含量差异不显著；刈割频率为“110”“111”“222”时，羊草叶中Ca 含量差异显著，分别提高了13.6%、21.8%、11.8%。刈割频率为“101”“110”“111”“222”时，14 种氨基酸总量分别提高了30.95%、40.19%、33.76%以及降低了99.76%。由此可知，在4 种刈割频率下羊草叶中Ca 含量“111”最高，“110”次之；14 种氨基酸总量“110”最高，“111”次之。本试验结果说明，在“111”（1年刈割1 次）和“110”（刈割2年休1年）刈割频率下，植物处于等补偿生长点，能够表现出最大的等补偿生长效应。对于天然羊草草原，1年刈割1 次和刈割2年休1年都是较为科学合理的刈割方式。