2%丁子香酚·香芹酚可溶液剂高效液相色谱分析

2022-06-16许艳秋陈丙坤王广成高立明

现代农药 2022年3期

李婷，聂果，许艳秋，陈丙坤，王广成，高立明

（四川省农药检定所，成都 610041）

丁子香酚（Eugenol）又名丁香酚，CAS登录号为97-53-0，EINECS（欧洲现有商业化学品目录）登录号为202-589-1，分子式C10H12O2，化学名称为4-烯丙基-2-甲氧基苯酚。因具备有抑菌、杀病毒的作用，其常作为医用药物，在农用方面作为植物源杀菌剂，对黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病等有较好防效，且与苦参碱合理混配后对葡萄灰霉病菌增效明显[1-3]。

香芹酚（Carvacrol）又名异百里香酚，CAS登录号为499-75-2，EINECS登录号为207-889-6，分子式C10H14O，化学名称为2-甲基-5-异丙基苯酚。香芹酚常用于消毒剂、杀菌剂、香料及化妆品的配方中。香芹酚作为植物源杀虫剂，对玉米害螨具有较好的防效；作为植物源杀菌剂，对辣椒白粉病、葡萄霜霉病具有较好防效，同时能够调节辣椒和葡萄生长，对杨梅致病菌也具有非常好的抑菌效果[4-7]。

目前，国内已有8个丁子香酚单剂、7个香芹酚单剂、1个两者混配农药登记，均是前景较好的植物源农药。国内外在饲料和中药材的香芹酚和丁子香酚的液相色谱分析方法已有相关报道[8-9]，使用高效液相色谱同时检测香芹酚和丁子香酚的质量分数的方法未见报道，因此本研究采用反相高效液相色谱法对丁子香酚·香芹酚可溶液剂进行定量分析。该方法操作简便、快速，准确度和精密度均能达到定量分析的要求，可以为企业生产过程质量控制和质检机构检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪、ZORBAX SB-C18色谱柱，安捷伦科技有限公司。丁子香酚标准品（纯度≥99.0%）、香芹酚标准品（纯度≥99.0%），山东西亚化学股份有限公司；2%丁子香酚·香芹酚可溶液剂，成都新朝阳作物科学股份有限公司；甲醇（色谱纯），四川西陇科学有限公司；磷酸（分析纯）、乙腈（色谱纯），成都市科隆化学品有限公司。

1.2 色谱条件

Agilent 1260 二极管阵列检测器；色谱柱：ZORBAX SB-C18［250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm］不锈钢柱；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30，V/V）；流量：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长275 nm；进样体积：5.0 μL；保留时间：丁子香酚约为5.2 min；香芹酚约为8.2 min。

上述典型操作条件，可根据不同仪器特点，对给定的操作条件作适当调整，以期获得最佳效果。典型的色谱图见图1和图2。

图1 标样液相色谱图

图2 试样液相色谱图

1.3 测定步骤

1.3.1 标样溶液的配制

准确称取丁子香酚标准品0.15 g、香芹酚0.05 g（精确至0.000 2 g），用甲醇溶解并用50 mL容量瓶定容；分别准确移取上述两者溶液10.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，备用。

1.3.2 试样溶液的配制

准确称取2%丁子香酚·香芹酚可溶液剂样品2 g（精确至0.000 2 g），用甲醇溶解并用50 mL容量瓶定容，超声波溶解提取10 min，用0.45 μm孔径滤膜过滤，收集滤液备用。

1.3.3 线性溶液的配制

分别称取丁子香酚标样0.167 2 g、香芹酚标样0.059 3 g于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成丁子香酚浓度为3.310 6 mg/mL、香芹酚浓度为1.174 1 mg/mL的混合标准母液。分别准确移取丁子香酚和香芹酚标准母液2.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。

1.3.4 测定

在1.2色谱操作条件下，待仪器基线稳定后，连续数针标准溶液进样，当相邻2针的峰面积变化小于1.5%时，按照标准溶液、试样溶液、试样溶液、标准溶液的顺序进样进行分析测定。

1.4 数据分析

根据标准品和样品溶液中丁子香酚和香芹酚的峰面积，按式（1）计算试样中丁子香酚和香芹酚的质量分数w。

式中：A1、A2分别为标样和试样溶液中丁子香酚（香芹酚）峰面积的平均值，mAU·min；m1为丁子香酚（香芹酚）标样的质量，g；m2为试样的质量，g；ws为标样中丁子香酚（香芹酚）的质量分数，%；5为丁子香酚（香芹酚）标样稀释倍数。

方法回收率P，%按照式（2）进行计算。

式中：m实测为加标样品有效成分质量的实测值，mg；m样品为试样中有效成分的理论质量，mg；m添加为试样中添加有效成分的质量，mg。

根据CIPAC方法验证指南[10]，评价该分析方法的精密度，即当精密度试验中的RSD＜RSDr时，精确性结果才是可接受的，按式（3）计算RSDr：

式中：RSDr为室内相对标准偏差，%；C为测定质量分数，%。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

通过二极管阵列检测器的光谱数据采集功能，对丁子香酚、香芹酚标样在190～400 nm波长下进行扫瞄。丁子香酚的最大吸收波长为220 nm，次大吸收波长为280 nm；香芹酚的主要吸收波长为220、275 nm。丁子香酚与香芹酚紫外曲线交叉点吸收波长为230、280 nm。因在低紫外补充下易产生杂质干扰，且香芹酚的含量较低，选择香芹酚的较大吸收波长275 nm作为方法的检测波长。经检测验证，在此波长下，2种物质均有较好的吸收，且无干扰杂质峰，基线平稳，峰高适中，故275 nm波长适用于本分析方法。

2.2 流动相的选择

分别用不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相，对试样进行分离检测。试验结果表明，采用甲醇-水为流动相时，出峰不对称，峰形拖尾；改用磷酸溶液为流动相，峰形对称；乙腈-0.1%磷酸水溶液，分离效果比较好，但乙腈成本较高、毒性较大，故选择甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30，V/V）作为流动相。其试样分离情况较佳，峰形对称，保留时间适中，是较好的分离条件。

2.3 方法的线性相关性分析

用1.3.3配制5个不同浓度的丁子香酚、香芹酚标准品溶液，丁子香酚浓度为0.264 9～1.324 2 mg/mL，香芹酚浓度为0.093 9～0.469 6 mg/mL，在1.2所述色谱操作条件下对系列溶液进行分析。以标准品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到丁子香酚的线性方程为y=4 019.6x＋12.548，R2=0.999 6；香芹酚的线性方程为y=3 880.6x-2.217 9，R2=0.999 7。丁子香酚和香芹酚的R2均大于0.999，则说明该方法线性关系良好。

2.4 方法精密度

取同一丁子香酚·香芹酚可溶液剂样品，按照1.2所述分析条件进行6次平行测定，结果见表1。丁子香酚质量分数平均值为1.514%，标准偏差为0.004 9%，RSD为0.32%；香芹酚质量分数平均值为0.531%，标准偏差为0.004 0%，RSD为0.75%。丁子香酚、香芹酚的RSD均远小于对应的RSDr，符合CIPAC方法验证指南要求，说明该方法精密度高。

表1 精密度测定结果

2.5 方法准确度

分别称取已测定质量分数的2%丁子香酚·香芹酚可溶液剂样品，每个样品中都加入一定量的丁子香酚和香芹酚标准品，按照1.2所述的色谱条件测定样品中丁子香酚和香芹酚的总质量，计算回收率，结果见表2。丁子香酚回收率范围为：98.73%～100.18%，平均值为99.52%；香芹酚回收率范围为：99.32%～100.64%，平均值为99.97%。丁子香酚、香芹酚的回收率在98.73%～100.64%，CIPAC方法验证指南中要求为97%～103%，满足定量分析对回收率的要求。