提取方法对枸杞多糖含量及体外抗氧化能力的影响

许兰仙++马文平

目的：研究枸杞多糖的提取方法对枸杞多糖抗氧化活性的影响，分析不同提取方法获得的枸杞多糖试样表现出抗氧化活性。方法：使用超声波-微波辅助提取方法提取，获得5种试样使用膜分离设备进行超滤获得2种试样；采用FRAP法、ABTS法和清除超氧阴离子自由基（SRSA）、螯合Fe2+能力测定（MC）、4种体外抗氧化方法来评价试样的抗氧化能力。结论：活性炭脱色导致多糖大量损失（P<0.05），除蛋白对试样多糖含量影响不大（p>0.05）；不同的抗氧化方法会得到不同的抗氧化结果，对多糖和抗氧化能力相关性进行分析表明，多糖和体外抗氧化能力之间相关性不强；综合比较各个试样的抗氧化能力，表明，使用使用超声波-微波辅助提取，并進行醇沉可获得枸杞粗多糖a具有相对好的体外抗氧化活性。

枸杞，棘如枸之刺，茎似杞之条，故名枸杞。是我国传统的名贵中药材和重要的经济作物，《神农本草经》将其列为上品。现代研究也发现它有抗氧化、延缓衰老、促进肿瘤细胞凋亡防止老年痴呆症、保护心脑血管等作用，而这些功能的核心是枸杞的抗氧化功能，因为，氧化应激和抗氧化的平衡调节是人体维持内环境稳定和正常生理功能的一个基本的调节体系，人体自我保护、抵御疾病的重要机制之一。枸杞多糖被公认为枸杞主要活性成分，因此，近二三十年来，枸杞多糖都是研究枸杞的要点和热点。王建华的研究表明，相同浓度下不同枸杞多糖清除羟基自由基和清除超氧阴离子自由基的能力均为枸杞总糖最好，而枸杞多糖级分则不如前者。杨薛康研究了枸杞醇提物和水提物的抗氧化作用，结果表明枸杞醇提物清除自由基的能力要强于水提物。张自萍研究了枸杞子提取液抗氧化活性，结果表明枸杞子中水溶性提取物的抗氧化活性高于脂溶性提取物。这些研究都涉及到了枸杞以及枸杞多糖的抗氧化活性。

本实验通过超声波-微波辅助提取法获得枸杞水提物（试样Ⅰ）、醇提物（试样Ⅱ）枸杞粗多糖a（试样Ⅲ，水提醇沉）、脱色粗多糖（试样Ⅲa）、枸杞总多糖（试样Ⅲa，脱色、脱蛋白）枸杞粗多糖b（试样Ⅳ，80%乙醇处理，水提）、；使用膜分离设备进行超滤获得截留样、透过液；将这些试样进行真空冷冻干燥保存。测定这些试样的多糖含量，并使用铁离子还原能力（FRAP）、清除超氧阴离子自由基能力（SRSA）、清除ABTS自由基能力、螯合金属铁离子能力（MC）、β-胡萝卜素漂白法（BCB）测定各个试样的抗氧化能力。目的在与探究不同制备方法获得的不同含量的枸杞多糖试样之间，体外抗氧化能力的差别。为获得高得率、抗氧化活性强的枸杞多糖试样作初步研究，为枸杞多糖的加工提供科学依据。

材料与方法

供试材料。试验原料：枸杞鲜果，2015、2016年7月上旬采摘于宁夏芦花台园林场，经挑选、除杂、清洗后储存于-60℃超低温冰箱。

主要试剂。ABTS、TPTZ、NBT、NADH、PMS、Troloxβ胡萝卜素、EDTA-2钠等。

主要仪器设备。超声波微波中药提取仪、高速冷冻离心机、全波段扫描酶标仪、紫外可见分光光度计等

实验方法。（1）试样的制备

计算各个试样得率及其多糖含量的测定

①铁离子还原抗氧化能力（FRAP法）

FRAP法参考Benzie 和Strain方法，略加改动。

②清除超氧阴离子自由基（SRSA法）

参照Robak的方法，略加改动。

③ABTS+·清除能力（ABTS法）

参照Siddhuraju的方法，略加改动

④螯合Fe2+能力测定（MC法）

参照Decker的方法，略加改动

上述的五种方法中除了螯合Fe2+能力测定以EDTA-二钠为对照之外，其他方法均以Trolox为对照。

（2）数据处理

实验所得数据由 WPS2016表格进行数据处理，经 SPSS（20.0）进行方差分析，用Sigma Plot（12.5）作图。

结果与分析

各试样的重量得率和枸杞多糖含量的测定。（1）试样的重量得率计算按照（1）进行计算，结果如图1所示

图1表示的是不同试样的得率，各个试样的得率依次为15.56±0.29%、10.85 ±0.03% 、7.23 ±0.23% 、1.98±0.06%、1.07±0.04%、2.55 ±0.46% ；试样得率大小顺序为：水提物（试样Ⅰ）>80%乙醇提取物（试样Ⅱ）>粗多糖a（水提醇沉，试样Ⅲ）>粗多糖b（醇提水溶，试样Ⅳ）>脱色粗多糖（试样Ⅲa）>总多糖（脱蛋白、脱色后多糖，试样Ⅲb）；各个试样的得率差异显著（P<0.05）。

（2）苯酚硫酸法测定试样中的枸杞多糖含量

以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=0.0079X+0.068 R2=0.9981

图2表示的是不同试样的枸杞多糖含量，各个试样多糖含量分别为：3.39±0.19，1.56±0.04、50.24 ±1.09 、11.46±0.22、12.11±0.18、19.70±0.31、9.76±0.27、20.31±0.28（g/100g）；试样枸杞多糖含量大小顺序为：粗多糖a（水提醇沉，试样Ⅲ）>截留液干燥品（超滤法，试样Ⅵ）>粗多糖b（醇提水溶，试样Ⅳ）>总多糖（脱蛋白、脱色后多糖，试样Ⅲb）>脱色粗多糖（试样Ⅲa）>透过液干燥品（超滤法，试样Ⅴ）>枸杞水提物（试样Ⅰ）>80%乙醇提取物（试样Ⅱ），用超声波-微波辅助法提取的各个试样多糖含量差异显著（P<0.05）

①不同提取方法对枸杞多糖得率及含量的影响

本实验采用的提取方法从广义上来说可以分为化学方法（溶剂提取法）和物理方法（膜分离）两类；从狭义上来讲，本实验采用的化学方法又可分为水提法、醇提法、水提醇沉、醇提水溶这四种方法。这里讨论狭义上的分类方法，即5种方法。

对于水提法（试样Ⅰ）， 枸杞中含有大量的水溶性成分，因此试样Ⅰ得率很高，枸杞水溶性成分除多糖了外还有水溶性黄酮、单糖、寡糖等，所以枸杞多糖含量相对低；对于醇提法（试样Ⅱ），80%的乙醇能够溶解出大量黄酮类物质，以及部分色素，还有极性较低的小部分多糖；对于水提醇沉法（试样Ⅲ），醇沉使得水提液中的单糖、寡糖、部分色素等与多糖分离，此时，枸杞多糖含量得到极大提高，同时，粗多糖a（试样Ⅲ）的得率也会相应降低；对于醇提水溶法（试样Ⅳ），提取手段和水提醇沉类似，醇沉能够将多糖从水提液中分离出来，但是试样Ⅲ的多糖含量明显高于试样Ⅳ（P<0.05），这是因为温度较低（4℃）、时间较长（12 h）醇沉过程相比于（50℃）、时间较短（不足1.5h）醇提过程更有利于多糖的析出；对于超滤法（试样Ⅴ和试样Ⅵ），本实验使用的超滤膜，其截留分子量大于10000 Da，枸杞多糖的分子量大于2000 Da，因此截留液中主要含有大分子的枸杞多糖，而透过液中含量分子量较小的枸杞多糖，以及单糖、寡糖、黄酮等物质。

②脱色、脱蛋白对试样多糖含量的影响

活性炭处理水提液除色素的同时，也会吸附多糖，活性炭脱色损失了大量的多糖；当将脱色水提液进行醇沉，试样Ⅲa中的多糖含量得到提高，但是明显低于试样Ⅲ（P<0.05），这是因为脱色水提中的多糖（P>0.05）含量明显减少，并远远低于试样Ⅰ中的多糖含量（P<0.05），使用活性炭对脱色使得枸杞多糖大大流失；对于试样Ⅲb，是在试样Ⅲa基础上，采用Sevage脱蛋白，多糖含量略微升高，说明游离蛋白含量较少。而在使用超滤法制备试样过程中，也使用活性炭脱色，但是试样Ⅵ的多糖含量大于试样Ⅲb；试样Ⅲb的制备使用水提取，而后通过醇沉分离出粗多糖，试样Ⅵ使用的是枸杞清汁，除了水溶性成分，还有一些脂溶性成分，通过酶解、脱色、澄清之后，采用超滤分离出枸杞多糖；两者多糖含量的差异，再次证明了提取方法对多糖含量的影响。

各个试样的抗氧化能力分析。

①各个试样铁离子还原能力（FRAP法）

FRAP法能够测定试样中所存在的任何还原性成分的还原能力。FRAP0.2表示当FRAP值为0.2时，所需的抗氧化物质的多少。试样的FRAP0.2越小铁离子还原能力越强。

除了试样Ⅲa、试样Ⅲb，其他试样的铁离子还原能力随着多糖含量的增加而增强，其中试样Ⅲ表现出最好的铁离子还原能力，但是试样Ⅲa、试样Ⅲb多糖含量并不是最低，说明铁离子还原能力与多糖含量有一定关系，结合相关性分析可知试样多糖含量与铁离子还原能力中度相关。试样Ⅲa、试样Ⅲb之所以没有表现出铁离子还原能力，可能是是脱色过程除掉的色素以及其他成分也会影响试样的铁离子还原能力。

截试样Ⅵ是用膜分离设备进行超滤分离取截留液获得的，超滤之前，对枸杞清汁进行活性炭脱色、并通过澄清除掉部分蛋白质；试样Ⅲb是枸杞水提液经过活性炭脱色、乙醇沉淀、Sevage法除蛋白获得的，没有表现出铁离子还原能力，试样Ⅵ同样经历了脱色、除蛋白、分离出多糖的过程，原因可能是提取方法不同，试样Ⅲb使用的是化学方法（制备过程涉及多种化学试剂），而截留液干燥品（试样Ⅵ，膜分离）使用的是物理方法（膜分离属于物理过程，且制备过程较少涉及化学试剂）

试样Ⅰ、试样Ⅱ多糖含量较低，铁离子还原能力较低，后者比前者铁离子还原能力明显高（P<0.05），这说明在还原铁离子能力这抗氧化角度，80%的乙醇提取物抗氧化活性强于水提物，李洋用10种不同极性溶剂提取枸杞中的活性成分，结果表明高浓度乙醇（约80.9%）提取物的抗氧化能力比水提物铁离子还原能力强。

②清除超氧阴离子自由基（SRSA）

超氧阴离子自由基是人体内活性自由基，当体内产生过多超氧阴离子自由基，超过内源性抗氧化防御系统对其消除能力时，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。当存在有效清除超氧阴离子自由基的清除剂时，可以使机体内的氧化和抗氧化重新恢复平衡。IC50表示抗氧化实现50%抑制时的浓度。在这里定义为IC50表示表示当自由基的清除率为50%时，抗氧化物质的浓度，试样的IC50越小清除超氧阴离子自由基能力越强。

从整体来看，除了多糖含量较少的试样Ⅰ、试样Ⅱ，使用化学方法即超声波-微波辅助法制备的试样比膜分离设备制备出来的试样清除超氧阴离子自由基能力都强；醇沉保留了某些清除超氧阴离子自由基的成分，这可能是由于试样Ⅴ、和试样Ⅵ膜分离制备过程中，经历了沸水浴灭酶和80℃的澄清，温度较高导致多糖活性遭受破壞；试样Ⅲa和试样Ⅵ从纯化、除杂角度上来讲有相似之处，但是两者清除超氧阴离子自由基能力差异显著（P<0.05）。

试样Ⅲb、Ⅲa、Ⅲ、Ⅰ它们清除超氧阴离子自由基的顺序为Ⅲb>Ⅲa>Ⅲ>Ⅰ，去除蛋白质、脱色、醇沉都可能有助于提高超氧阴离子清除能力，Lin等用沸水提取，乙醇沉淀，蛋白酶水解除蛋白获得多糖（CE）粗提物多糖（CP），去蛋白多糖（DP）；并研究其抗氧化性活性，同一浓度下清除超氧阴离子自由基能力大小为DP>CP>CE。和本实验大小顺序一致。

综上所述，清除超氧阴离子自由基能力与试样的制备方法、温度有关系，多糖含量过高、过低都会影响清除超氧阴离子自由基能力。

③清除ABTS自由基

ABTS 法是使用最广泛的间接检测方法之一，可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。

试样Ⅱ中的多糖含量是所有试样中多糖含量最少的，80%醇提物里的成分主要是黄酮类化合物，而试样Ⅴ，经过超滤收集的透过液，里面主要含有相对小分子量的多糖、寡糖及单糖以及黄酮类化合物。而两者清除ABTS自由基能力相对其他样品较强（P<0.05），说明黄酮类化合物在清除ABTS自由基能力中产生较大的作用，而试样Ⅰ中也有一部分水溶性黄酮，但是清除ABTS自由基能力却明显弱（P<0.05），说明脂溶性黄酮比水溶性黄酮清除ABTS自由基能力更强。

试样Ⅲ和试样Ⅳ均为枸杞粗多糖，除了试样Ⅱ和试样Ⅴ，它们的抗氧化活性相对较高（P<0.05），而试样Ⅲa、试样Ⅲb经过除掉色素和除色素、除蛋白获得的试样，说明了除色素过程除掉了某些清除ABTS自由基的成分。

④螯合Fe2+能力的测定（MC法 ）

Fe2+、Cu2+可介导脂质过氧化，Fe2+还是羟自由基等自由基产生的媒介物，因此限制金属离子的活动，即螯合金属铁离子能力能够间接阻止氧化反应，螯合金属离子能力反应了抗氧化剂在抑制、阻碍促氧化能力。

从表4中可以看出来，各个试样和浓度存在线性关系（R2>0.9）；但是它们的螯合能力较弱，高浓度下，螯合率仍不足50%。

试样Ⅲa、试样Ⅲb、试样Ⅳ的螯合Fe2+能力差异不显著（P<0.05），它们的制备过程都包括活性炭脱色，试样Ⅳ，在水提之前，先用80%的乙醇处理，也除掉一部分色素，说明色素的去除有利于螯合Fe2+。

多糖含量和抗氧化能力的相关性分析。

如表5所示，在FRAP法中，多糖含量与铁离子还原能力相关性系数0.5≦∣r∣≦0.8，說明试样多糖含量与其铁离子还原能力中度相关；在SRSA法，0.3≦∣r∣<0.5， 说明试样多糖含量与其清除超氧阴离子能力低度相关；在ABTS法、MC法、BCB法中，∣r∣<0.3，说明试样多糖含量螯合金属能力、抑制β-胡萝卜素褪色能力均没有关系。

各个试样的抗氧化能力大小在各个抗氧化方法中的排列顺序。

从表6中可以看出，综合各个反应的结果可以看出，试样Ⅲ即粗多糖a和试样Ⅲb总多糖的抗氧化效果相对好。

结论

（1）用超声波-微波辅助提取法制备的6种试样及用超滤法制备获得两种试样的得率和多糖含量有差别。不同提取方法对枸杞多糖含量和得率均产生影响，其中粗多糖a（试样Ⅲ，水提醇沉）得率相对高，且其多糖含量最高；活性炭脱色导致多糖大量损失（P<0.05），除蛋白对试样多糖含量影响不大。

（2）用四种体外抗氧化方法对试样抗氧化能力进行测定，测定结果显示不同体外抗氧化方法测定出来的各个试样体外抗氧化能力强弱顺序不同。综合结果表明，枸粗多糖a（试样Ⅲ，水提醇沉），总多糖（试样Ⅲb，脱色，脱蛋白）表现出相对好的抗氧化能力效果，结合两个试样的得率，在加工利用枸杞多糖时，应使用超声波—微波辅助提取，并进行醇沉，可获得得率相对高、抗氧化活性较好的试样。

（3）试样中枸杞多糖和体外抗氧化能力相关性分析结果表明，枸杞多糖和体外抗氧化活性有一定的关系，但是并没有高度相关；经过各个试样的抗氧化能力大小在各个抗氧化方法中的排列顺序可知，枸粗多糖a（试样Ⅲ，水提醇沉），总多糖（试样Ⅲb，脱色，脱蛋白）表现出相对好的抗氧化能力效果。