液相色谱-串联质谱法测定香蕉中吡虫啉的不确定度评定

贾映霞

（北京市产品质量监督检验研究院，北京 101300）

香蕉作为热带水果，属于芭蕉科，位列联合国粮食及农业组织制定的世界粮食作物榜的第4 位。同时，它还是世界经济作物的第8 位。所有的热带水果中，香蕉的消耗量是世界上最高的。国内香蕉大多产自海南、两广、福建和云南[1-2]。香蕉含有大量维生素、膳食纤维等人体所需的营养物质，也含有少量生物活性成分，如多酚与黄酮等[3-4]。香蕉具有润肠通便、改善代谢综合征、治疗腹泻和抗氧化等保健功能[5-9]。在香蕉的种植过程中难免受到病虫害的威胁，现阶段防治香蕉病虫害的主要手段是化学药剂防护。吡虫啉是一种硝基亚甲基类杀虫剂，主要用于粮食作物以及果蔬防治蚜虫等虫害，其原理是破坏农业害虫的烟酸乙酰胆碱酯酶受体，以达到麻痹害虫神经从而使害虫死亡的目的。吡虫啉的使用会对粮食作物及果蔬造成不同程度的药物残留[10]。

《食品国家安全标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）规定吡虫啉的ADI 值是0.06 mg/kg bw，吡虫啉在香蕉内的最大残留限量为0.05 mg/kg[11]。该标准也规定了香蕉中吡虫啉的检测标准可参考《水果和蔬菜中450 种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB/T 20769—2008）[12]、《水果、蔬菜及茶叶中吡虫啉残留的测定 高效液相色谱法》（GB/T 23379—2009）[13]。

近年来，水果中农药残留超标的问题层出不穷，因此检测结果的准确性非常重要。不确定度可评价实验中各因素对测量结果准确度的影响。本研究以《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[14]和《水果和蔬菜中450 种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB/T 20769—2008）[12]为依据，科学研究了测定香蕉中吡虫啉含量的不确定度。明确实验过程中对实验结果产生影响的主要因素，以期为水果中吡虫啉的准确测定提供参考，同时使本实验室能更好地满足《检测和校准实验室能力认可准则》（CNAS—CL01：2018）[15]中日常检验工作质量控制的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香蕉，购买于生鲜超市；甲苯、甲酸溶液（色谱纯，Fisher 公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，沃凯公司）；氯化钠（优级纯）；无水硫酸钠（分析纯）；Sep-Pak Vac 氨基固相萃取柱（1 g，6 mL，安谱公司）。标准品：吡虫啉标准品（100 mg，纯度为98.00%，CHEM SERVCE）。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪串联质谱联用系统UPLCMS/MS-8050（日本岛津）；N-EVAP112 氮气吹干仪（美国Organomation 公司）；2323K 高速台式冷冻离心机（德国Hermle 公司）；Milli-Q 高纯水仪（美国Millipore 公司）；XP205 电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；旋转蒸发仪；SNMXZ1601精度匀浆器（美国OMNi 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备溶液配制（1 mg/mL）：准确称取0.010 0 g 吡虫啉标准品（100 mg，纯度为98.00%）于10 mL 容量瓶内，加入甲醇溶液溶解样品并定容，手动摇晃瓶身使其混合均匀。

标准工作溶液制备（1 μg/mL）：取标准储备溶液0.1 mL 于100 mL 容量瓶内，加入甲醇溶液定容，摇晃均匀，备用。

标准系列工作曲线的制备：准备7个10 mL 容量瓶，分别取吡虫啉标准工作溶液0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL 和0.80 mL。加入甲醇溶液定容到刻度，得到的溶液浓度分别为0.001 μg/mL、0.002 μg/mL、0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.020 μg/mL、0.040 μg/mL 和0.080 μg/mL。

1.3.2 样品前处理

向100 mL 离心管内加入20.00 g 香蕉样品、40 mL 乙腈。以高速组织捣碎机进行1 min 的匀浆提取，捣碎机的转速为15 000 r/min。加入5 g NaCl 进行1 min 的 匀 浆 提 取， 在3 800 r/min 条 件 下 离 心5 min，离心完成后，吸取20 mL 上清液，并于40 ℃水浴环境下旋转浓缩至体积为1 mL 左右，待净化。

在Sep-Pak Vac 柱中加入高度约2 cm 的无水Na2SO4，并将其放置在下方放有鸡心瓶的支架上。在样品加入前，要先使用甲苯与乙腈的混合物4 mL对固相萃取小柱进行清洗（甲苯与乙腈的体积比为1 ∶3）。待液面与Na2SO4的顶部持平，以较快的速度把样品的浓缩液转移到净化柱内，与此同时替换为新鸡心瓶接收液体。使用与前述体积比相同的甲苯与乙腈的混合液2 mL 对样品瓶进行洗涤，共需洗涤3 次。洗涤完成后，将清洗液转移至柱内。在柱上安装容量为50 mL 的储液罐，使用甲苯与乙腈的混合物25 mL 进行洗脱（甲苯与乙腈的体积比为1 ∶3）。在鸡心瓶内混匀，在40 ℃的水浴环境中旋转浓缩至0.5 mL 左右为止。浓缩液用氮气吹干仪吹干后，快速加入水与乙腈的混合液1 mL 混合均匀（水与乙腈的体积之比为2 ∶3），用0.2 μm 的滤膜过滤，过滤结束后移至液相色谱-串联质谱仪内进行测定[12]。1.3.3 液相色谱-串联质谱测定条件

色谱柱：Atlantis T3，150 mm×2.1 mm，3 μm；流动相：A 为0.05%甲酸水，B 为乙腈；柱温：40 ℃；进样量20 μL；离子源：ESI；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾压：5 000 V；雾化气压力：0.483 MPa；气帘气压力：0.138 MPa；辅助加热气：0.379 MPa；离子源温度：725 ℃。

1.3.4 数学模型的建立

香蕉中吡虫啉计算公式如下：

式中：x为被测样品中吡虫啉含量，mg/kg。Ci为样品内待测组分的浓度，μg/mL。C0为空白样品内待测组分浓度，μg/mL。V1为样品提取液总体积，mL；V2为过净化柱的样品体积，mL；V3为样品最终定容体积，mL；m为样品质量，g。其中，Ci与C0是由标准曲线得到的。

2 结果与分析

2.1 不确定度主要来源

根据实验过程和数学模型分析计算可知，香蕉中吡虫啉测定的不确定度来源主要有标准溶液的配制、样品前处理、标准工作曲线的拟合和重复性测量。

2.2 不确定度评定

2.2.1 标准溶液配制引入的不确定度

（1）由吡虫啉标准物质引入的不确定度。根据吡虫啉标准品证书提供信息，吡虫啉标准品的纯度为98.00%，扩展不确定度为0.5%，其服从正态分布。置信水平P=98%，包含因子k=2，是B 类评定，相对不确定度为：

（2）配制吡虫啉标准工作液与制备系列曲线时量器校准引入的不确定度。在此过程中共用A 级10 mL容量瓶9 个，A 级1 mL 吸量管6 个，A 级5 mL 吸量管4 个，B 级2 mL 吸量管1 个，A 级100 mL 容量瓶2 个。玻璃量均具有一定的最大允差，按矩形分布规律估算其相对不确定度，结果如表1 所示[16]。由玻璃量具校准引入的相对不确定度为：

表1 标准工作溶液配制过程中量具校准引入的不确定度

2.2.2 样品前处理引入的不确定度

（1）样品称量引入的不确定度。样品称样量为20.00 g。查阅相关权威资料，得到质量允许差Δy为0.05 g，其置信水平P为99%。考虑为正态分布，包含因子k=2[17]。样品称量引入的不确定度为：

样品称量引入的相对不确定度为：

（2）样品前处理量取溶液引入的不确定度。对样品进行前处理使用的玻璃量器包括50 mL 的量出式量筒1 个、1 mL 的A 级单标吸量管1 个。查阅相关的国家标准可知50 mL 量筒（量出式）容量允差为0.5 mL，1 mL 单 标 吸 量 管（A 级）容 量 允 差 为0.040 mL，经过计算后引入的相对标准不确定度值分别为0.072 1、0.004 62。对样品预处理时，量取溶液的过程中引入的相对不确定度为：

样品的预处理过程中引入的不确定度为：

2.2.3 标准工作溶液的线性拟合引入的不确定度

在本实验中采用标准工作曲线来校正样品中吡虫啉残留量的大小。各浓度的标准溶液进行1 次测定，横坐标代表吡虫啉浓度，纵坐标代表峰面积，则标准曲线方程是Y=19 298 200x+6 952.79，R2=0.998 8，结果如表2 所示。

表2 标准曲线拟合结果

对香蕉试样重复测定3 次，使用标准曲线对样品中的吡虫啉进行校准，可以得到x0=0.029 7，依据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL006：2019）[18]可以得到由标准曲线引入的相对标准不确定度为：

式中：s为峰面积标准偏差；n为标准溶液测定次数；xi为标准溶液浓度，μg/mL；b为标准曲线斜率；p为试样测定次数；x0为试样内吡虫啉的含量，μg/mL；x—为标准溶液浓度平均值，μg/mL。

2.2.4 重复性测量引入的不确定度

样品的重复进样引入的不确定度属于A 类评定，该值代表仪器的重复性是否良好，其由表3 数据计算。则由重复性测量引入的相对标准不确定度为

表3 重复进样测量结果

2.3 合成标准不确定度

通过计算可得，测定香蕉内吡虫啉含量的合成标准不确定度为：

2.4 扩展不确定度

扩展不确定度U=合成标准不确定度×包含因子。其中，置信度P=95%，则k=2。因此，本实验测得的相对扩展不确定度为：

样品内吡虫啉含量的最佳估计值，记作x，x=0.029 6 mg/kg，故对应的扩展不确定度为：

U=0.029 6×0.336 4=0.009 96 mg/kg

则香蕉中吡虫啉测定结果为（0.029 6±0.009 96）mg/kg，k=2。

3 结论

本文以液相色谱-串联质谱法为理论依据对香蕉内的吡虫啉含量进行了详细的测定，研究了不确定度来源，分析了主要来源对实验结果的影响程度。结果显示，实验结果主要受到标准曲线拟合引入的不确定度的影响，标准物质溶液配制引入的不确定度对实验结果存在轻微影响。因此，在检测过程中要确保标准溶液曲线配制的准确性，增加标准曲线中各点的测定次数，保证标准曲线的相关性符合规定；在仪器方面，及时做好对照品的期间核查以及仪器设备的校准和检定，为提高检测结果的准确性，降低误判风险提供保障。