血管生成因子VEGF与子宫内膜异位症血瘀证的相关性研究*

郑萍萍，王小红

1 福建中医药大学中医学院 福建福州 350122

2 福建中医药大学附属人民医院妇产科 福建福州 350004

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMT）是指子宫内膜组织（腺体和间质）在子宫体以外的部位生长，主要症状为进行性加重的痛经、不孕、月经异常以及性交痛，严重影响妇女的生活质量和身心健康[1]。其发病机制尚无定论，多数学者认可郎景和教授的内膜细胞要完成黏附（Attachment）-侵袭（Aggression）-血管形成（Angiogenesis）的“AAA”发病模式[2]。血管生成是其中的重要环节。研究表明，血管内皮生长因 子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是目前具有最强促血管生长作用的因子，在新生血管生成过程中起着关键性的调控作用[3，4]。中医学认为，“瘀阻胞宫”是EMT的基本病机[5]，研究表明，VEGF与EMT血瘀证关系密切，活血化瘀药物可有效降低EMT患者的血管生成因子水平，抑制异位内膜的发生发展，从而减轻患者的相关临床症状[6-8]。但中医界大多局限于药物研究、临床疗效分析及动物模型研究；而EMT血瘀证的相关分子机制及中医学现代基础机制研究缺乏。本文通过检测VEGF在EMT患者血清及异位内膜中的表达，并分析其与EMT血瘀证患者血瘀积分的相关性，以期为临床EMT的中医诊治提供和补充现代基础理论的支持和依据。

资料与方法

1 诊断标准

1.1 西医诊断标准 参照第9版妇产科学[1]及2015年子宫内膜异位症的诊治指南[9]。

1.2 血瘀证诊断标准 采集的患者的临床表现，将所得信息录入“中医健康状态辨识系统”进行标准化辨证，参照朱文锋《证素辨证学》进行诊断[10]。并通过加权阈值的方法，计算证素积分及分级，见表1。

表1 血瘀证素积分分级

2 入组标准

2.1 纳入标准 均经术后病理确诊且证素辨证属血瘀证；月经规律，且术前3个月内未使用激素类药物治疗者；同意参加本次课题研究并签署知情同意书。

2.2 排除标准 不符合诊断标准或术前3个月使用激素类药物者；子宫内膜病变、癌前病变及恶性肿瘤患者；近期皮肤有烫伤、烧伤、挫伤等大面积损伤，可能影响研究结果的病史者。

3 一般资料

选取2020年1月-2021年1月于福建中医药大学附属人民医院妇科病房住院的患者120例，实验组为术前证素辨证为血瘀证，行腹腔镜手术术后病理确诊EMT的患者60例；对照组为术前证素辨证为血瘀证，行腹腔镜切除子宫术后病理诊断排除EMT及子宫腺肌病的患者60例。2组的年龄，血瘀积分及血瘀分级等一般资料比较，差异无统计学意义，2组具有可比性。见表2。

表2 2组一般资料比较

4 研究方法

4.1 标本的采集及保存 血清：于术前月经干净后2～3d的清晨，空腹抽取2组患者静脉血（肘部）5ml，静置于常温下1h，在3000 r/min转速下离心20min，取上清液于冻存管，保存在-80℃冰箱中待检，避免反复冻融。内膜组织：实验组腹腔镜术中取异位内膜组织（内膜异位囊肿壁组织），对照组子宫切除术后取子宫内膜组织，置于有RNA保护液中保存在冻存管中，于-80℃冰箱中保存待检，避免反复冻融。

4.2 检测方法 采用ELISA方法检测血清中VEGF的水平：采用人血管内皮细胞生长因子（VEGF）试剂盒（MM-0115H1，酶免），实验严格按照试剂盒说明书，采用全自动酶标仪（WD-2102B，六一）进行检测，得到OD值和标准物的浓度，求出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式求出样品浓度。采用Real-time PCR方法检测内膜组织中VEGF mRNA的表达：采用超纯RNA提取试剂盒（CW0581M，CWBIO，康为世纪）提取内膜组织中的mRNA并用紫外分光光度仪测定RNA浓度、纯度，用5×HiScript II qRT SuperMix II进行逆转录反应，采用2×SYBR Green PCR Master Mix进行扩增，采用CFX Connect™实时荧光定量PCR仪进行扩增反应和荧光定量；并绘制扩增曲线及熔解曲线，运用2-△△CT法对数据进行相对定量分析。

5 统计学方法

统计分析采用SPSS 20.0统计学软件，以P＜0.05有统计学意义。计量资料以（±s）表示，2组计量资料进行正态性检验，符合正态分布2组间比较采用t检验，不符合正态分布2组间比较采用秩和检验；多组计量资料采用单因素方差分析；计数资料采用卡方检验；两变量相关性采用直线相关分析。

结 果

1 2组血清中VEFG及内膜中VEGF mRNA的表达

2组患者术前血清中VEGF水平及内膜组织中VEGF mRNA的相对表达量经非参数检验，结果显示2组有差异，实验组患者血清中VEGF及异位内膜组织中VEGF mRNA的水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 2组血清中VEFG及内膜中VEGF mRNA的表达情况比较（±s）

表3 2组血清中VEFG及内膜中VEGF mRNA的表达情况比较（±s）

组别 例数 VEGF/pg·ml-1 VEGF mRNA实验组 60 94.74±19.976 3.08±1.554对照组 60 52.17±12.507 1.35±1.157 Z 9.127 6.477 P＜0.05 ＜0.05

2 EMT患者血清中VEGF及内膜中VEGF mRNA与血瘀积分的关系

EMT患者血清中VEGF及异位内膜组织中VEGF mRNA与血瘀积分经直线相关分析，结果提示EMT患者血清中VEGF及异位内膜组织中VEGF mRNA的表达与其血瘀积分均具有相关性，呈正相关，相关系数分别为r=0.543和r=0.556（P＜0.05）。见表4。

表4 EMT患者血清中VEGF及内膜中VEGF mRNA与血瘀积分关系比较

讨 论

对于EMT的现代医学的病因及发病机制的探究，主要包括子宫内膜异位种植学说、体腔上皮化生学说、诱导学说等。经血逆流种植学说认为在经期时，经血可带着脱落子宫内膜组织，由输卵管逆流入腹腔并种植于盆腔腹膜组织及卵巢上，不断发展形成盆腔异位病灶[1，11]。但是“经血逆流”并不能完全阐明EMT的逆流后，子宫内膜在腹腔内的复杂的发病过程，郎景和[12]提出的发病三部曲AAA模式，补充并完善了经血逆流种植学说的分子生物学机制。血管生成是“3A”的发病模式中的重要环节。局部异位内膜的宫腔黏膜以外部位的生长取决于新生血管的形成，血管生成在EMT的发生、发展中扮演着重要的角色。VEGF[13，14]被认为是目前具有最强的促血管生长作用的一种血管生长因子。目前对于EMT，还缺乏高敏感度的临床检测方法，寻找无创的生物学检测方法，能为疾病的早期诊断和治疗，以及疾病的预防和随访提供有效的简易的方法。

1 EMT患者血清中VEFG及内膜中VEGF mRNA的表达

VEGF是具有最高特异性的血管内皮细胞的有丝分裂剂，能诱导内皮细胞有丝分裂进行增生，促进局部新生毛细血管网结构的形成；能通过降解破坏细胞外基质，改变血管的通透性，使血浆蛋白及生长因子外渗，为局部新生组织提供营养和基质，促进新生毛细血管结构的塑造和成纤维细胞与血管内皮细胞形成组织间质[15]。本实验结果显示VEGF在2组患者的血清中的表达，差异具有统计学意义（P＜0.05），实验组表达水平明显高于对照组。同时，许晓月、崔轶凡等[16，17]研究表明，内异症患者血清中可以发现VEGF，其血清中VEGF呈高表达。与本研究结论相一致。VEGF在EMT患者血清中表达存在异常，不仅能证明VEGF在本病发病中可能存在促进的作用，同时也为未来早期发现并诊断内异症的检测指标提供新的选择。

VEGF主要在子宫内膜细胞的间质细胞、腺体细胞以及间质中的巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞中表达[32]。VEGF在月经周期中子宫内膜的修复工作中也发挥着作用。内膜细胞在卵巢的激素的促进作用下能分泌VEGF，由于EMT的异位病灶和子宫在位的内膜腺体和间质具有组织同源性，所以异位内膜在卵巢的激素影响下也可分泌VEGF，VEGF可降解细胞外基质，破坏基质的屏障作用，改变局部的微环境，从而促进异位病灶的进一步发生和发展[18]。李灿宇等[19]实验结果表明，VEGF在EMT的在位内膜及异位内膜的表达水平均高于在正常内膜组织中的水平，且VEGF在在位内膜及异位内膜中的水平比较，差异无统计学意义。本课题结果显示，2组组织中VEGF mRNA的水平差异具有统计学意义（P＜0.05），异位内膜中的VEGF mRNA水平高于对照组，于上述研究结果相符合。在异位内膜中VEGF的高表达，能够诱导内皮细胞的增殖，促进新血管的形成，使异位内膜得以成功种植、发展，异位病灶进一步浸润、蔓延，不断扩大对盆腔周围组织的破坏，使盆腔周围组织的粘连等病理变化呈持续性发展，可见异位病灶中VEGF的表达增高是异位病灶种植、蔓延的重要因素，在发生、发展中起重要作用。

2 EMT患者血清中VEGF及内膜中VEGF mRNA与血瘀积分的关系

中医学普遍认为，本病的发病根本是“瘀血阻滞胞宫、冲任”，现代医学认为子宫内膜异位症的发病与经血逆流，内膜细胞在宫腔外的种植、浸润及血管形成有关，这与中医学的“离经之血”久而致瘀的理论相符合。而治疗上，研究证实，抗VEGF抗体的抗血管生成药物治疗能有效延缓疾病发展，而中医学的活血化瘀治疗能明显减低患者的血管生成因子水平，并且改善EMT患者临床症状体征、减低术后复发率及提高受孕率[20]，治疗方案上的原则、思路及疗效上基本一致。通过现代医学的微观的分子生物学机制与中医学的宏观的临床症状体征相结合，能够探究中医临床证候的现代学的内在机理。本研究通过收集临床症状体征计算血瘀证素积分，研究血瘀程度与VEGF的相关性发现：EMT患者血清中VEGF水平及内膜中VEGF mRNA的表达量与血瘀积分的关系，经直线相关分析显示，两者均呈正相关（P＜0.05）。EMT患者血清及内膜中的VEGF与血瘀积分均具有相关性。且其相关趋势与前面论述的VEGF对疾病发生发展的作用相符合。为临床EMT的中医病机辨证诊断提供客观的现代理论基础及生物学机制支持，同时也为EMT的临床中医活血祛瘀等治疗方案提供了新的现代学理论依据。

综上所述，血管生长在EMT的发病过程中起着不可替代的重要作用，VEGF在血管生成的整个过程中都参与了调控的作用；VEGF与EMT血瘀证的证候内在本质之间存在相关性，为临床EMT的中医诊治提供和补充现代基础理论的支持和依据。