肉及肉制品微生物检测新技术研究进展

胡三梅

（北京电子科技职业学院后勤基建处，北京 100076）

肉及肉制品富含蛋白质、脂类、维生素以及铁、锌等矿物质，是优质动物蛋白的重要来源，同时我国肉及肉制品产量巨大，近10 年肉类平均年产量近8 505 万t， 其中肉制品产量占15%～20%，其食用安全性备受人们关注。2021年国家市场监督管理总局及各省、直辖市、自治区公布的本年度监督抽检情况显示，肉及肉制品共1 264 批次不合格，不合格项目类别主要涉及兽药、微生物、添加剂、质量指标、污染物、标签、非法添加等，其中微生物不合格数量达到346 批次，占不合格总数的27.4%（注：因国家市场监督管理总局及各地市场监督管理局抽检公告较多，此处仅列出国家市场监督管理总局2021年最后一项抽检公告）。本文介绍肉及肉制品中微生物限量要求，分析传统微生物检测方法的弊端，综述快速测试片法、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生物荧光法、分子诊断法、免疫分析法、光谱法及仪器法等新技术在肉及肉制品微生物检测应用中的研究进展。

1 我国肉及肉制品相关标准中微生物限量要求

肉及肉制品的营养成分适宜微生物的生长繁殖，微生物数量也是肉及肉制品相关标准中的重要卫生指标和安全指标，相关标准中对微生物的限量要求如表1～2所示。

表 1 肉类（原料肉）相关标准中的微生物限量要求Table 1 Microbial limit requirements specified in meat standards

表 2 肉制品相关标准中的微生物采样方案及限量要求Table 2 Microbial sampling scheme and limit requirements specified in processed meat standards

由表1～2可知，对肉及肉制品有限量要求的微生物种类包括菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、致泻大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌（O157:H7）、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌和单核细胞增生李斯特氏菌，其中菌落总数和大肠菌群代表产品的卫生情况，在鲜牛肉、肉松、肉脯、火腿肠、熏煮火腿、熏煮香肠等产品标准中为出厂检验指标，每批次均需检验合格后方能出厂。

2 传统微生物检测方法

传统微生物检测采用食品安全国家标准食品微生物检验4789系列标准，如GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》、GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB 4789.6—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》、GB 4789.36—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》、GB 4789.5—2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》、GB 4789.11—2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 β型溶血性链球菌检验》及GB 4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》。通常需提前配制稀释管、培养基，对使用的稀释管、培养基和相关耗材进行高压灭菌，经样品处理、稀释、加样、培养、计数等环节才能得到检测结果，通常需2 d以上，操作费时费力。为能得到准确结果的同时缩短检测时间、降低检测成本，研究人员开发了新型的微生物检测技术。

3 肉及肉制品微生物检测新技术

3.1 快速测试片法

快速测试片法是将培养基系统预先制备在测试片上，微生物菌落在测试片上呈红色或粉红色，可增强微生物计数效果。赵立冬等分别使用快速测试片法与 GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》检测熟肉样品、人工污染熟肉样品的菌落总数结果一致性，发现2 种方法检测结果相关系数分别为0.897、0.964，检测结果一致性较好。快速测试片法与传统的平板计数法原理相同，但该方法无需提前配制培养基、稀释液，检测步骤较少、效率高，培养时间仅需24 h，可大幅节省检测时间，同时可节省菌落总数检测过程中的时间和人力成本，目前已形成成熟的商业化产品。

3.2 ATP生物荧光法

ATP广泛存在于生物活体内，且每个微生物活菌细胞中均有含量近似的ATP，荧光素酶是一种生物活性催化剂，可将ATP的化学能转化为光能。ATP在具备荧光素酶、氧气、镁离子的环境中可与荧光素反应产生荧光，荧光强度与ATP含量呈线性关系，通过检测生物荧光即可间接获得菌落总数。黄彬等优化肉及肉制品中微生物ATP提取方法，分别采用十六烷基三甲基溴化铵和-环糊精为微生物细胞ATP的提取剂和中和剂，发现当肉制品中微生物浓度为10～10CFU/mL时测得的发光强度对数值与平板计数结果对数值相关系数为0.929 1，可用于实际检测，但因无法排除体细胞ATP的影响而不适用于原料肉的菌落总数检测。

3.3 分子诊断法

3.3.1 多重实时聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法

多重实时PCR是在常规PCR的基础上加入多对特异性引物，通过DNA聚合酶催化及碱基配对实现对引物界定的DNA样品中不同序列扩增，具有检测通量高、灵敏度高、成本低等优势，近年来发展迅速。Elisa等利用多重实时PCR方法同步检测肉制品中沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单核细胞增生李斯特氏菌，若样品中只含有这3 种致病菌中的一种，则检测限可达10 CFU/g， 若样品中有3 种致病菌，则检测限为10CFU/g。范维等使用多重实时PCR的方法同步检测散装即食肉制品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌，增菌5 h后，3 种微生物的检出限分别达到3.8、4.9、5.7 CFU/mL。 熊苏玥等利用多重实时PCR方法同步检测香肠中的金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7及霉菌，5 种致病微生物在20 h内的检出限均可达100 CFU/25 g。Nguyen等先将鸡肉中沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7与单核细胞增生李斯特氏菌增菌12 h，再使用多重实时PCR检测，与不增菌直接检测相比可将检出限降低1 个数量级。闫琳等将人为接种沙门氏菌的禽肉增菌12 h后，再利用多重实时PCR检测，检出限可低至100 CFU/25 g。由此可见，多重实时PCR检测微生物，尤其是致病菌的高灵敏度是建立在增菌培养处理的前提下，增菌时间越长，灵敏度越高，实际检测过程中需根据样品情况在检测时间和检测限二者间进行平衡。

3.3.2 等温扩增技术

等温扩增技术仅需简单的恒温仪器既可实现核酸体外扩增，已成为PCR扩增技术的替代性选择，包括环介导等温扩增、滚环扩增、单引物扩增等技术。 Ledlod等开发了基于环介导等温扩增技术和双向侧流试纸相结合的方法，可在45 min内快速检测肉品中单核细胞增生李斯特氏菌，检出限达20 CFU/g。Chen Xingxing等开发了基于等温扩增技术的猪肉制品金黄色葡萄球菌快检方法，检出限达50 CFU/mL。等温扩增技术的缺点在于对引物设计的要求较高，同时易形成气溶胶，造成假阳性，影响检测结果。

3.4 免疫分析法

3.4.1 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术是一种以胶体金作为标记物应用于检测特定抗原或抗体的一种新型免疫标记技术。胶体金在弱碱性环境下带负电荷，可与带正电荷基团的蛋白质分子、伴刀豆球蛋白A、植物血浆凝集素、萄球菌A蛋白等生物大分子结合，在显微镜下呈黑褐色，若有大量结合物聚集则用肉眼即可观察到粉红斑点，可用于定性或半定量的快速免疫检测。刘志科等开发出鸡白痢沙门氏菌胶体金免疫层析快速检测试纸条，与其他病原菌无交叉反应，检测结果与平板凝集实验符合率达到96.4%。Song Chunmei等成功研制出一种胶体金免疫层析试纸条，用于快速检测肉冻等食品中志贺氏菌和大肠杆菌O157:H7。胶体金免疫层析技术的缺点在于无法实现高通量检测，且其准确性高度依赖抗体的特异性。

3.4.2 荧光量子免疫试纸条法

荧光量子表面具有不同的官能团，通过修饰即可与抗体等生物大分子偶联，同时荧光量子点具有稳定性好、荧光强度高等特点，可提高免疫层析试纸条的灵敏度和稳定性。朱芳茜等利用自制的量子点偶联志贺氏菌单克隆抗体，研制了一种可视化检测志贺氏菌的量子点免疫荧光试纸条，该试纸条在猪肉、火腿肠等样品中的检测限为1×10CFU/mL，单样品检测时间为15 min。荧光量子免疫试纸条法的缺点在于检测限较高，目前仍无法满足肉制品中致病菌的检测限量要求。

3.5 光谱检测

3.5.1 近红外光谱法

近红外光谱波长为780～2 526 nm，是介于可见光与中红外光之间的电磁波，可反映分子化学键基频振动的倍频和合频吸收，结合化学计量学方法（如偏最小二乘法）可实现快速、无损、多组分同步检测含氢官能团的有机物，已广泛应用于猪胴体、鲜猪肉、鲜牛肉及冻牛肉、鲜羊肉、鲜鸡肉、羊肉卷、牛肉汉堡饼等肉及肉制品的检测。Alexandrakis等利用近红外光谱法可定性识别鸡胸肉中是否含李斯特菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、门多萨假单胞菌和大肠杆菌。Argyri、Panagou等采用傅里叶变换红外光谱建立了冷却牛肉腐败程度预测模型，新鲜、半新鲜、腐败冷却牛肉识别准确率分别达到91.7%、81.2%和94.1%，并可直接预测菌落总数。Grau等开发了基于短波近红外光谱技术的包装切片鸡胸肉新鲜度快速定性检测技术，可与腐败特征指标菌落总数的指示作用保持一致。

3.5.2 表面增强拉曼光谱法

光束照射到物体表面时出现的少部分折射光方向和波长均发生变化的散射为拉曼光谱。不同的被照射物质分子中的官能团各不相同，由此产生振动的拉曼光谱可提供分子结构信息，从而实现对被照射物质的快速检测。但是拉曼光谱易受干扰，导致信号较弱，通过贵金属表面糙化处理可使拉曼信号增强，这种现象被称为表面增强拉曼，可实现痕量物质的快速检测。Ma Xiaoyuan等在多刺纳米金粒子上修饰巯基化适配体作为表面增强拉曼纳米探针，检测猪肉样品中的沙门氏菌，检测限为4 CFU/mL，加标回收率为96.55%～105.45%。Zhang Hui等利用适配体固定化磁性纳米金粒子捕获猪肉样品中的金黄色葡萄球菌，经优化后表面增强拉曼法检出限为35 CFU/mL，加标回收率为94.12%～102.75%。拉曼光谱也可反映肉中蛋白质结构变化，从而反映肉的腐败变质程度。

3.5.3 高光谱成像技术

高光谱成像技术是一种光谱和图像融合的光电检测技术，能同时反映样品内外部的信息，光谱波段覆盖了紫外、近红外、可见光区域，分辨率可达纳米级别，是一种融合光学、计算机、信号处理学的检测技术。Peng Yankun等开发基于高光谱成像系统的猪肉菌落总数检测技术，使用逐步判别法筛选出可表征菌落总数的5 个最佳波长，通过最小二乘支持向量机建立了理想的预测模型。郭中华等开发了可检测羊肉表面菌落总数的高光谱成像系统，经优化的人工神经网络模型相关系数可达0.998 8。赵俊华等利用高光谱成像技术开发腊肉菌落总数的定量分析技术，校正集和预测集相关系数分别为0.808和0.798。李文采等以市售冷藏鸡胸肉为研究对象，建立基于高光谱成像技术的菌落总数快速预测模型，校正集和验证集相关系数分别为0.93和0.86。 王伟等以生鲜猪肉为研究对象，选用最小二乘支持向量机的建模方法构建基于高光谱成像技术的细菌总数预测模型，与标准平板菌落总数记数法所检测的细菌总数相关系数达到0.94以上。

光谱法对肉及肉制品中有机物含量有较好的预测效果，同时具有一定的定性判别能力，但目前光谱类设备价格较高，未开发出针对不同产品基质的微生物检测专用设备，且多为预测方法，仍需对其预测准确性进行大量验证才可进行实际应用。

3.6 仪器法

3.6.1 流式细胞术

流式细胞术是融合流体力学、激光学、荧光染色科学和计算机科学的细胞分析技术，具有快速、多指标、分析全面等特点。随着流式细胞术在各领域中的应用越来越多，商品化的流式细胞仪也越来越成熟。微生物通常由分析型的流式细胞仪检测，该设备包括液流系统、光路检测系统和检测分析系统，将待测样品制成单细胞悬液，经液流系统进入光路检测系统，细胞在激光照射下发生散射和折射，产生的散射光信号和荧光信号由不同的通道接收，经计算机分析处理得出检测结果。 黄韵分别采用Guava EasyCyte 6-2 L流式细胞仪和平板计数法对冷鲜肉中的单增李斯特菌进行检测，研究发现，单增李斯特菌在4 ℃冷鲜肉中经过16 d培养后流式细胞仪和平板计数法检测结果分别为5.4×10、5.3×10CFU/g， 二者结果十分接近。流式细胞术的缺点在于只能对细胞等生物分子进行分析检测，肉及肉制品等食品中不同基质需使用不同的荧光染料标记，存在荧光信号重叠的可能性，会降低检测准确性。

3.6.2 电化学法

微生物在培养过程中，生理代谢作用使培养基的电惰性物质（如碳水化合物、类脂、蛋白质）转化为电活性物质，大分子物质转化成小分子物质，体系的阻抗降低，因此可以通过测定体系中电流或电位的变化规律，构建电流或电位与微生物浓度的关系模型，进而测定出体系中微生物的浓度。这种方法具有测定快速、直观、操作简单、测定设备成本低和信号可控等特点。 刘飞等依据微生物呼吸作用的电子传递规律，采用原电池的工作原理，开发基于电化学法的冷鲜肉中菌落总数快速预测技术，预测值和实测值的差异（预测值和实测值差值的绝对值与其平均值的比率）在15%以内。

4 结 语

食品安全法规定，食品应检验合格后方可出厂或销售，而传统微生物检测方法检验周期较长，菌落总数和大肠菌群2～3 d、食源性致病菌3～5 d，对鲜牛肉、熏煮香肠等保质期较短且出厂必须检测微生物的肉及肉制品造成了极大的流通压力和经济损失，因此微生物检测新技术和仪器在肉类领域具有巨大的市场需求。本文综述6 种类型、11 种肉及肉制品微生物检测新技术的研究进展，多数具备节省检测时间的优势，满足了肉类企业缩短检测周期的需求，但多数检测方法仍停留在实验室研究阶段，存在实际检测应用对比数据偏少、仪器商品化程度低等问题，建议加强检测新技术与传统检测方法在实际样品检测应用中的比对工作，改进检测方法细节，进一步提高检测准确率，同时推动新技术的标准化，加快新技术与设备在实际检测中的应用。