利用AhMITE分子标记对花生杂交F1代的真伪鉴定

徐彪 李玉发 牛海龙 李伟堂 刘红欣 王伟 吴松权 何中国

摘要 [目的]提高花生育种效率。[方法]从10对AhMITE引物中筛选出对杂交亲本具有差异条带的标记引物，分别对10个花生杂交组合197个F1 代单株进行真伪杂种鉴定。[结果]根据PCR扩增的父母本带型，共鉴定出75个真杂种单株，真杂种比例为38.02%。[结论]利用AhMITE分子标记可以快速、准确地对花生杂交F1 代进行真伪鉴定，为进一步使用AhMITE分子标记技术对吉林省花生新品种选育及花生种质资源遗传多样性分析提供技术支撑。

关键词 花生;F1真伪鉴定;AhMITE标记

中图分类号 S565.2  文献标识码 A  文章編号 0517-6611（2022）11-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.024

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Identification of F1 Generation Peanut Hybrids Using AhMITE Molecular Markers

XU Biao1，2，LI Yu-fa2，NIU Hai-long2 et al

（1.Agricultural College of Yanbian University，Yanji，Jilin 133000;2.Jilin Academy of Agricultural Sciences，Gongzhuling，Jilin 136110）

Abstract [Objective]In order to improve the efficiency of flower breeding.[Method]Screened from 10 pairs of AhMITE primers for the marker primers with different bands in the hybrid parents，197 F1 single plants of 10 peanut cross combinations were used to identify the true and false hybrids.[Result]According to the parental band type amplified by PCR，a total of 75 true hybrid single plants were identified，and the true hybrid ratio was 38.02%.[Conclusion]The AhMITE molecular marker can be used to quickly and accurately identify the authenticity of the peanut hybrid F1 generation.It is expected to provide technical support for the further use of the AhMITE molecular marker technology in the selection of new peanut varieties in Jilin Province and the analysis of the genetic diversity of peanut germplasm resources.

Key words Peanut;F1 authenticity test;AhMITE mark

栽培花生  （Arachis hypogaea  Linn.） 是世界上种植最广泛的食用豆类之一，因其高蛋白质与不饱和油含量而受到重视[1]。杂交育种是花生新品种选育的主要途径，然而在花生去雄过程中母本的8个雄蕊清除不彻底或不及时，经常会导致F1出现假杂种[2]。传统表型鉴定花生真伪杂种的方法，对于父母本表型差异较小的杂种很难辨认，而通过分子标记技术鉴定花生F1代真伪杂种极大地提高了鉴别准确性。

微型反向重复转座子（miniature inverted repeat transposable element，MITE）是 由Bureau等[3]最先在玉米中发现并命名的，且大多数分布于真核组织中。MITE通常在植物基因组中扩增，像DNA 转座子一样，拥有TIR和TSD，但不编码转座酶[4]。MITE标记技术扩增结果用琼脂糖凝胶即可鉴定，相比聚丙烯酰胺凝胶鉴定，操作简单方便，在玉米、水稻等植物上得到有效应用[5-6]。

有关AhMITE在花生上的应用，Patel等[7]利用MITE标记将2种含有插入的突变体与正常油酸花生品种和天然存在的高油酸突变体区分开。Gayathri等[8]从33个不同基因型的花生全基因组重测序数据（WGRS）中鉴定出465个已报道的标记，共获得2 957个新的AhMITE1标记。Kolekar等[9]使用MITE标记对锈病抗性进行了验证。王辉等[10]通过AhMITE分子标记技术对115份花生材料进行DNA多态性及聚类分析。以上结果表明，MITE可以广泛地应用于花生育种，为花生新品种选育及优异种质创制奠定基础。目前关于利用 AhMITE 转座子分子标记技术对花生进行真伪鉴定的报道很少，王洁等[11]利用7对转座子引物对166个F1单株进行鉴定，真杂种比率为47.59%。尹亮等[12]建立了使用杂交种子子叶 DNA并结合AhMITE技术对F1代杂交种进行真伪鉴定技术的研究。

笔者利用10对多态性AhMITE引物对10个花生杂交组合进行F1代真伪杂种鉴定，旨在为吉林省选育花生新品种和种质创新提供技术支撑，同时为今后使用AhMITE分子标记技术进行遗传多样性分析及遗传连锁图谱构建提供前期基础。

1 材料與方法

1.1 试验材料 共选用 10个花生杂交组合，共14 份花生F1代亲本材料（表1）。亲本及 F1代均于2021年5月7日种植于吉林省农业科学院花生育种研究团队杂交池。

1.2 基因组DNA提取及检测

采用TIANGEN公司DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒的方法，提取花生基因组DNA，使用超微量分光光度计（Nano Drop 2000）和琼脂糖电泳检测DNA质量和浓度，将总DNA稀释为20 ng/μL，置于-20 ℃保存备用。

1.3 AhMITE标记引物筛选

从文献[13]中选取10对 AhMITE引物（表2），由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。利用这10对AhMITE引物对亲本进行多态性分析，选出条带清晰、稳定、有明显差异的标记用于F1代杂种鉴定。

1.4 PCR扩增程序及扩增产物检测

PCR反应体系（10 μL）： Taq  PCR Master Mix 5 μL，AhMITE正向引物（15 μmol/L）1 μL，AhMITE反向引物（15 μmol/L）1 μL，DNA 模板（20 ng/μL）1 μL，其余用ddH2O补足。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，55～58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，30个循环;72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。 PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，添加0.8 μL Gold View Ⅰ 型核酸染色剂在凝胶分子成像仪器上成像保存。

1.5 真伪杂种鉴定

使用对父母本有多态性的AhMITE引物，对杂种F1代进行PCR扩增，扩增带型表现为杂合的为真杂种，带型与母本相同为假杂种。

2 结果与分析

2.1 F1 代群体 DNA 提取 该试验提取的花生组DNA，经超微量分光光度计检测OD260/OD280在2.0左右。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，条带清晰，质量较高，可以用于后续试验，结果见图1。

2.2 亲本多态性AhMITE标记引物的筛选 该试验选择的 10对AhMITE引物在14个杂交亲本中均可扩增出条带。其中，引物 AhTE0544使组合1、4、5、6、7、8、10的双亲条带具有明显差异，父母本带型的分子量在100～500 bp（图2、3）;AhTE0577 使组合2、3、9的双亲条带具有明显差异，父母本带型的分子量在100～500 bp（图4、5）。因此选用AhTE0544和AhTE0577 引物对14个杂交亲本F1代进行真伪鉴定。

2.3 F1后代真伪杂种鉴定

筛选出对父母本有显著差异的AhMITE标记引物，分别对10个花生杂交组合进行真伪杂种鉴定。扩增条带仅表现为父本或者母本的为伪杂种，表现为杂合带型的为真杂种。部分鉴定结果见图3、5～6，10个杂交组合的真杂种比例见表1。其中，第5个组合真杂种率最高，达47.37%，第1个组合真杂率最低，仅25.00%，10个杂交组合平均真杂种比例为38.02%。

3 讨论

花生杂交是选育优异新品种和种质创新最常用、最简单的方法之一[14]。为了提高杂交群体的质量，对杂种F1代进行准确鉴定至关重要。由于花生染色体数目和基因型差异较大，导致花生不同品种间表型上差异也较大[15]。在分子标记未被广泛应用之前，对于F1代真伪杂种的鉴定基本采用形态标记法，费时费力，且准确性不高。分子标记的鉴定不受外界环境的制约，直接反应不同品种间差异，在作物早期即可鉴定[16]。花生F1杂种鉴定大多采用简单重复序列（SSR）标记，鉴定结果较好，但是制作聚丙酰胺凝胶及跑胶过程较为复杂。此外，利用SNP位点进行鉴定，准确性高，但是对于DNA浓度要求极高[17]。该试验利用AhMITE转座子标记技术对F1杂种进行真伪鉴定，AhMITE重复性好，稳定性高，易操作，极大地提高了鉴定效率。

近年来，祁雪等[18]采用原位胚拯救技术并利用MITE转座子分子标记对F1代进行鉴定，真杂种率为44.3%;和小燕等[19]采用SNP位点突变碱基G-T、籽仁表型性状、SSR多态性标记分析、四引物扩增突变体系PCR和Sanger测序基因峰值图分析4种方法对F1代进行真伪杂种鉴定;宁龙龙等[20]利用AhMITE转座子标记对F1后代群体78个单株进行了鉴定，真杂种率为25.64%;仇静静等[21]利用MITE转座子和SSR标记对各杂交组合的F1代杂交种进行真伪检测，254粒杂交F1中共鉴定出96粒真杂交种。

4 结论

该研究利用AhMITE分子标记可以快速、准确地对花生杂交F1 代进行真伪鉴定，可极大地提高花生育种效率，也可为进一步使用AhMITE分子标记技术对吉林省花生新品种选育及花生种质资源遗传多样性分析奠定理论基础。

参考文献

[1]

周小静，任小平，黄莉，等.花生种质资源研究进展与展望[J].植物遗传资源学报，2020，21（1）：33-39.

[2] 熊发前，钟瑞春，韩柱强，等.花生的一种高效育种和种植方法[J].农业与技术，2018，38（11）：87-88.

[3] BUREAU T E，WESSLER S R.Tourist：A large family of small inverted repeat elements frequently associated with maize genes[J].The plant cell，1992，4（10）：1283-1294.

[4] FESCHOTTE C，JIANG N，WESSLER S R.Plant transposable elements：Where genetics meets genomics[J].Nature reviews genetics，2002，3（5）：329-341.

[5] ZHANG X，FESCHOTTE C，ZHANG Q，et al.P instability factor：An active maize transposon system associated with the amplification of Tourist-like MITEs and a new superfamily of transposases[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，2001，98（22）：12572-12577.

[6] KIKUCHI K，TERAUCHI K，WADA M，et al.The plant MITE mPing is mobilized in anther culture[J].Nature，2003，421（6919）：167-170.

[7] PATEL M，JUNG S，MOORE K，et al.High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into the  FAD2  gene[J].Theoretical and applied genetics，2004，108（8）：1492-1502.

[8] GAYATHRI M，SHIRASAWA K，VARSHNEY R K，et al.Development of  AhMITE1  markers through genome-wide analysis in peanut （ Arachis hypogaea  L.）[J].BMC research notes，2018，11：1-6.

[9] KOLEKAR R M，SUJAY V，SHIRASAWA K，et al.QTL mapping for late leaf spot and rust resistance using an improved genetic map and extensive phenotypic data on a recombinant inbred line population in peanut （ Arachis hypogaea  L.）[J].Euphytica，2016，209（1）：147-156.

[10] 王輝，李双铃，任艳，等.利用  AhMITE  转座子分子标记研究花生栽培种及高世代材料的亲缘关系[J].农业生物技术学报，2013，21（10）：1176-1184.

[11] 王洁，李双铃，王辉，等.利用  AhMITE1  转座子分子标记鉴定花生 F1 代杂种[J].花生学报，2012，41（2）：8-12.

[12] 尹亮，任艳，石延茂，等.利用  AhMITE1转座 子分子标记鉴定栽培花生杂交F1代种子真伪[J].山东农业科学，2015，47（12）：1-5.

[13]黄璐.栽培花生种质资源遗传多样性研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2018：18-19.

[14] 曹广英，吴琪，王云云，等.利用 SSR标记鉴定花生杂交 F1代真假杂种[J].山东农业科学，2016，48（1）：7-10，15.

[15] 严玫，韩锁义，董文召，等.SSR标记在中国花生研究中的应用[J].中国农学通报，2012，28（6）：1-7.

[16] 苏君伟，于树涛，史普想，等.花生分子标记的研究进展[J].安徽农业科学，2011，39（10）：5704-5705，5710.

[17] 赵婷，王俊宏，徐国忠，等.花生高产优质育种与生物技术应用的研究进展[J].热带作物学报，2011，32（11）：2187-2195.

[18] 祁雪，王传堂，王秀贞，等.原位胚拯救技术获得花生属区组间杂种的研究[J].花生学报，2017，46（1）：21-25.

[19] 和小燕，张建航，刘婷，等.花生F1代真伪杂种鉴定方法分析[J].分子植物育种，2018，16（2）：477-483.

[20] 宁龙龙，刘佳佳，赵昆昆，等.利用 AhMITE转 座子标记鉴定花生F1代真伪杂种[J].山东农业科学，2019，51（9）：63-67.

[21] 仇静静，赵钰涵，邓丽，等.花生杂交F1种子真伪的分子鉴定研究[J].山东农业科学，2018，50（2）：13-18.