微小RNA-22对髓母细胞瘤细胞恶性生物学行为的影响及其机制▲

潘思安 黄永凯 欧阳倩 朱潇鹏

(湖南省株洲市中心医院1 康复治疗科，2 神经外科，株洲市 412000，电子邮箱：rpfdkm@163.com)

髓母细胞瘤属后颅窝恶性胶质瘤，占儿童脑肿瘤的8%～10%，是儿童常见的恶性神经系统肿瘤之一，患儿常有颅压增高、头痛、嗜睡、厌食、恶心、呕吐等表现，肿瘤压迫小脑时可出现共济失调现象[1-2]。目前，临床上常采用手术、颅脊髓照射和化疗等方法治疗髓母细胞瘤，虽然这些方法可显著提高患者生存率，延长生存期，但仍有约三分之一的患者在确诊后5年内死亡，而且现有疗法的长期副作用明显，可引起患者神经认知和听力受损、内分泌功能障碍、继发恶性肿瘤的发生率增加等情况[3-4]。因此，寻找新的治疗方法治疗髓母细胞瘤是临床亟待解决的关键问题。微小RNA是指长度为19～25个核苷酸的非编码单链小RNA，主要通过与目的基因的3′非翻译区结合从而调控mRNA翻译，可作为候选生物标志物用于疾病的诊断和治疗[5-6]。多项研究表明，微小RNA-22(microRNA-22,miR-22)在乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌等恶性肿瘤中的表达下调，具有肿瘤抑制作用[7-8]。但关于miR-22在髓母细胞瘤发生和发展中作用的研究报告较少，其调节作用机制尚未清楚。故本研究通过观察miR-22对髓母细胞瘤细胞恶性生物学行为的影响,并基于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路分析其潜在的作用机制，为髓母细胞瘤的治疗寻找新的靶标。

1 材料和方法

1.1 细胞来源与培养 人髓母细胞瘤细胞系UW402、UW473、DAOY和ONS-76细胞，以及正常人神经细胞RGC-5细胞，均购自美国ATCC公司。将细胞培养于含有10%胎牛血清的杜氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)，培养条件为37℃、饱和温度、5% CO2。每2～3 d传代一次，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2 实验动物 20只无特定病原体级6周龄雄性BALB/c裸鼠，体重18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号码：SCXK(京)2017-0011]。饲养条件：室温(22±1)℃，湿度(50±10)%，每天定时换气，保持12 h：12 h光暗照明，自由进食、饮水。

1.3 试剂与仪器 DMEM培养基(货号：31600)、细胞计数检测(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒(货号：CA1210)、Transwell小室(货号：G4740)、基质胶(货号：M8370)、结晶紫染液(货号：C8470)、胎牛血清(货号：S9020)、青链霉素混合液(100×，货号：P1400)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液(货号：T1300)、TRIzol裂解液(货号：R1100)、膜联蛋白Ⅴ(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡检测试剂盒(货号：CA1020)、RIPA裂解液(货号：R0010)、二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒(货号：PC0020)均购自北京索莱宝科技有限公司；吉姆萨染色试剂盒(货号：E607314)购自上海生工生物工程股份有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒(货号：11668027)、RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(货号：K1622)购自美国ThermoFisher公司；实时荧光PCR引物、miRNA NC/mimics由广州锐博生物科技有限公司合成；PI3K、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K，p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)兔单抗购自美国CST公司(批号：4249、17336、4691、4060)，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自英国Abcam公司(批号：ab181602、ab205718)；740Y-P(PI3K激动剂)购自大连美仑生物技术有限公司。IX53型显微镜购自日本奥林巴斯；TGL16MB型高速冷冻离心机购自长沙湘智离心机仪器有限公司；ELx800型酶标仪购自美国Bio-Tek公司；CytoFLEX S流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；DYCZ-24KS型双板垂直电泳仪购自北京六一仪器厂；G:BOX型多功能凝胶成像系统购自Syngene公司。

1.4 实验方法

1.4.1 实时定量PCR法检测细胞miR-22表达水平：取对数生长期的W402、UW473、DAOY、ONS-76和RGC-5细胞，胰酶消化、2 000 r/min离心15 min后收集细胞沉淀，加入适量TRIzol裂解液提取细胞总RNA，检测RNA浓度和纯度后，按照反转录试剂盒说明书的步骤将RNA反转录为cDNA。PCR反应体系包括dNTPs 0.5 μL、5×Buffer 5 μL、Taq酶0.3 μL、MgCl21.5 μL、cDNA模板2 μL、上下游引物各1 μL，加去离子水至总体积为25 μL。反应参数为95℃ 5 min，95℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 30 s，重复40个循环，最后72℃ 10 min，4℃ 5 min终止反应。以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt的方法计算目的基因相对表达水平，实验重复3次。引物序列见表1。

表1 基因的引物序列

1.4.2 细胞转染及分组：收集对数生长期的DAOY细胞，以5×105个/孔接种到6孔板中，加入DMEM培养基。将DAOY细胞分为对照组、miR-22 NC组、miR-22 mimics组、miR-22 mimics+740Y-P组进行实验。当细胞生长融合至70%～80%时，参照LipofectamineTM2000试剂说明书给予miR-22 NC组、miR-22 mimics组、miR-22 mimics+740Y-P组细胞分别转染miR-22 NC、miR-22 mimics、miR-22 mimics，对照组仅加入LipofectamineTM2000试剂，miR-22 mimics+740Y-P组细胞转染miR-22 mimics 24 h后添加10 μmol/L的740Y-P 200 μL。各组转染6 h后更换为正常培养基，继续培养48 h后通过检测对照组、miR-22 NC组、miR-22 mimics组细胞的miR-22表达情况评估转染效率，然后进行后续实验。

1.4.3 CCK-8法检测细胞增殖能力：转染48 h后，收集各组细胞，消化、800 r/min离心5 min、重悬后计数，以3×103个/孔的浓度接种于96孔板中，置于5% CO2培养箱中37℃培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后加入CCK-8试剂，继续放置于培养箱中孵育4 h，于酶标仪630 nm波长处读取光密度值。实验重复3次。

1.4.4 Transwell法检测细胞侵袭能力：转染48 h后，收集各组细胞，将细胞消化、800 r/min离心5 min、重悬后，采用无血清的DMEM培养基稀释细胞，按照2×104个/孔的浓度接种于已铺有基质胶的上室，每孔200 μL，下室加入600 μL的DMEM完全培养基，置5% CO2培养箱中37℃继续培养48 h后，取出上室，用甲醇固定20 min，棉签擦掉上室残余细胞，1%的结晶紫染色15 min，磷酸缓冲盐溶液冲洗2遍，置于显微镜下观察，选取4个高倍视野(400×)进行细胞计数，取平均值。实验重复3次。

1.4.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况：转染48 h后，收集各组细胞，胰酶消化使用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，1 mL 结合缓冲液重悬，调整细胞密度为1×106个/mL，每管加入100 μL细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min，加入5 μL PI，室温避光孵育5 min，加入磷酸缓冲盐溶液至500 μL，混匀后使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.4.6 蛋白免疫印迹法检测细胞PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平：转染48 h后，收集各组细胞，加入RIPA裂解液提取细胞蛋白，并采用二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，测定蛋白浓度。每个样本取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶80 V、分离胶120 V电泳2 h，60 V转膜2 h将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜后，将膜置于5%脱脂奶粉中室温环境下封闭2 h，放入相应一抗(稀释比例均为1∶2 000)于4℃孵育过夜，第2天用TBST清洗3次，10 min/次，加入二抗(稀释比例为1∶1 000)于37℃孵育2 h，TBST清洗3次，滴加发光液，放入凝胶成像系统显影。ImageJ软件分析各个蛋白对应的灰度值，以GAPDH为内参照，计算蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.4.7 裸鼠皮下移植瘤实验：小鼠适应性饲养3 d后，按随机数字表法分为对照组、miR-22 NC组、miR-22 mimics 组、miR-22 mimics+ 740Y-P组，每组5只。将1.4.2中转染48 h后的对照组、miR-22 NC组、miR-22 mimics 组、miR-22 mimics+740Y-P组细胞(100 μL，1×107个/mL)注射至相应组别小鼠的右前肢皮下。待肿瘤组织生长至约100 mm3时，使用游标卡尺测量肿瘤体积，瘤体积(mm3)=0.5×长径(mm)×短径2(mm2)，每周测量1次，取第4周(第28天)时的测量结果进行分析。

1.5 统计学分析 应用SPSS 25.0 软件进行统计分析，GraphPad Prism 8.0作图。计量资料以(x±s)表示，多样本比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5种细胞中miR-22的表达水平 与正常人神经细胞RGC-5细胞比较，人髓母细胞瘤细胞系UW402、UW473、DAOY和ONS-76中miR-22细胞的相对表达水平均降低(均P<0.05)，其中DAOY细胞miR-22的相对表达水平最低(均P<0.05)，见表2。选择miR-22相对表达水平最低的DAOY细胞为研究对象进行后续实验。

表2 5种细胞的miR-22相对表达水平比较(x±s)

2.2 转染效率的评估结果 与对照组比较，转染miR-22 NC未改变DAOY细胞中miR-22的表达水平(P>0.05)，转染miR-22 mimics后，DAOY细胞中miR-22的表达水平升高(P<0.01)，证明转染成功。见表3。

表3 3组细胞的miR-22相对表达水平比较(x±s)

2.3 miR-22对DAOY细胞增殖能力的影响 转染48 h后，继续培养24～120 h，miR-22 NC组DAOY细胞的增殖能力与对照组差异无统计学意义(均P>0.05)，而miR-22 mimics组DAOY细胞增殖能力均低于对照组和miR-22 NC组(均P<0.05)，miR-22 mimics+740Y-P组DAOY细胞的增殖能力均高于miR-22 mimics组(均P<0.05)。见表4。

表4 4组细胞增殖能力的比较(x±s，吸光度值)

2.4 miR-22对DAOY细胞侵袭能力和凋亡情况的影响 与对照组比较，miR-22 NC组穿膜细胞数量和凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组和miR-22 NC组比较，miR-22 mimics组的穿膜细胞数量减少，且凋亡率增加(P<0.05)；与miR-22 mimics组比较，miR-22 mimics+740Y-P组的穿膜细胞数量增加，且凋亡率降低(P<0.05)。见表5和图1、图2。

表5 4组细胞侵袭能力和凋亡率的比较(x±s)

图1 4组DAOY细胞的侵袭能力(×400)

图2 4组DAOY细胞凋亡情况

2.5 miR-22对DAOY细胞PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平的影响 与对照组比较，miR-22 NC组DAOY细胞PI3K和Akt磷酸化水平差异无统计学意义(均P>0.05)；与对照组和miR-22 NC组比较，miR-22 mimics 组PI3K和Akt磷酸化水平降低(均P<0.05)；与miR-22 mimics组比较，miR-22 mimics+740Y-P组细胞PI3K和Akt磷酸化水平升高(均P<0.05)。见表6和图3。

表6 4组细胞DAOY细胞PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平的比较(x±s)

图3 miR-22对DAOY细胞PI3K/Akt信号通路蛋白的表达及磷酸化水平的影响

2.6 miR-22对DAOY细胞皮下移植瘤的影响 与对照组比较，miR-22 NC组裸鼠皮下移植瘤体积差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组和miR-22 NC组比较，miR-22 mimics组裸鼠皮下移植瘤体积减小(均P<0.05)；与miR-22 mimics组比较，miR-22 mimics+740Y-P组裸鼠皮下移植瘤体积增大(P<0.05)。见表7和图4。

表7 4组裸鼠皮下移植瘤体积的比较(x±s，mm3)

图4 4组裸鼠皮下移植瘤大小

3 讨 论

髓母细胞瘤是最常见的儿童恶性脑肿瘤，其5年总生存率低至40%，尽管髓母细胞瘤的早期检查和治疗方法已有很大改进，但该病仍是导致儿童死亡的主要原因之一，且其转移率和复发率均较高[9-10]。因此，寻找新的治疗靶标对于髓母细胞瘤的临床治疗具有重要意义。

人类基因组中所包含的具有编码蛋白质功能的基因约20 000个，仅占整个基因组的1.5%左右，其余的基因被称为非编码RNA[11]。非编码RNA最初被认为是基因组的转录“噪音”，随着研究的不断深入，学者们逐渐发现无论是长链或是短链非编码RNA，均对多种人类疾病具有调控作用[12]。研究证明，成熟的微小RNA可以通过3′-非翻译区、5′-非翻译区甚至mRNA编码序列的不精确互补来调节靶基因的表达[13]。最近的研究表明，miR-22是哺乳动物中高度保守的微小RNA，在肿瘤发生和进展过程中发挥双重作用，例如miR-22在白血病和前列腺癌中具有致癌作用，而在肺癌和结肠癌中发挥抑癌作用[14-15]。然而，目前miR-22在髓母细胞瘤中的作用尚未清楚。在本研究中，我们发现，与正常人神经细胞相比，髓母细胞瘤细胞系UW402、UW473、DAOY和ONS-76细胞中miR-22均呈低表达状态，提示miR-22的低表达可能与髓母细胞瘤的发生过程有关。为了进一步研究miR-22低表达与髓母细胞瘤的关系，本研究以miR-22表达水平最低的DAOY细胞为研究对象，给予转染miR-22后，采用CCK-8法、Transwell法和流式细胞仪分别检测细胞的增殖活性、侵袭能力及凋亡情况。结果表明，上调miR-22的表达可抑制DAOY细胞的增殖、侵袭等生物学行为，并促进细胞凋亡，提示在髓母细胞瘤中miR-22可能发挥抑癌作用。

PI3K信号通路对于机体正常发育，以及包括癌症在内的多种疾病的进展都具有重要作用，PI3K可通过与不同的结构域结合而被激活，Akt是PI3K下游关键蛋白之一，活化的p-PI3K可与Akt结合，促使Akt磷酸化活化，激活PI3K/Akt信号通路，进而影响肿瘤发生和发展过程[16]。例如，Duan等[17]研究发现，PI3K/Akt信号通路在结直肠癌细胞中处于活化状态，该信号通路的激活可促进结肠癌的发生和发展；Wang等[18]的研究表明，抑制PI3K/Akt信号通路可抑制肺癌A549细胞的迁移、侵袭及上皮细胞-间充质转化过程。研究表明，微小RNA可通过调节多种信号通路及基因表达参与恶性肿瘤的发生和发展[19]。因此我们进一步检测各组细胞中PI3K和Akt磷酸化水平，探讨miR-22的抑癌作用与PI3K/Akt信号通路的潜在关系。本研究结果显示，上调miR-22的表达可降低PI3K和Akt磷酸化水平，抑制PI3K/Akt信号通路激活，这提示miR-22改变DAOY细胞增殖、侵袭及促凋亡的作用可能与调节PI3K/Akt信号通路的表达有关。为了进一步验证miR-22是否通过PI3K/Akt信号通路发挥作用，本研究使用PI3K激活剂740Y-P对细胞进行干预，结果显示，740Y-P提高了PI3K和Akt磷酸化水平，激活PI3K/Akt信号通路，削弱了miR-22 mimics抑制细胞增殖、侵袭的作用，降低了细胞凋亡率。随后，我们将转染处理后的各组细胞移植于裸鼠皮下，观察miR-22对DAOY细胞体内成瘤能力的影响，发现miR-22表达上调后，DAOY细胞移植瘤的体积小于对照组和miR-22 NC组，使用740Y-P处理细胞后，DAOY细胞移植瘤的体积大于miR-22 mimics组，与上述研究结果一致。这提示，miR-22可能通过PI3K/Akt信号通路影响DAOY细胞的体内及体外恶性生物学行为。

综上所述，miR-22在髓母细胞瘤细胞系中表达下调，上调miR-22的表达可抑制DAOY细胞的增殖、侵袭并促进细胞凋亡，同时可抑制皮下移植瘤的生长，其作用机制可能与调节PI3K/Akt信号通路的表达有关，miR-22可作为髓母细胞瘤的潜在治疗靶点。