长白落叶松种子园遗传多样性分析
2022-06-15邱新宇张磊张含国闫平玉
邱新宇 张磊 张含国 闫平玉
摘 要：為分析长白落叶松生产群体的遗传多样性及其变化趋势，为落叶松优良种质资源收集、保护和多世代遗传改良提供科学依据。该文从270对松科SSR（Simple Sequence Repeat）通用引物中筛选出多态性高的30对引物，利用SSR分子标记对林口县青山林场长白落叶松种子园105个单株进行遗传分析。结果表明，30对引物共检测到258对等位基因，群体平均观测等位基因数（Average number of observed alleles，Na）为2.833，平均有效等位基因数（Average number of effective alleles，Ne）为1.814，平均观测杂合度（Average observed heterozygosity，Ho）为0.404，平均期望杂合度（Average expected heterozygosity，He）为0.401;群体内近交系数（Inbreeding coefficient in population，Fis）、群体总近交系数（Total inbreeding coefficient in population，Fit）均为负值，表现出群体轻微杂合子过量，未出现近交衰退现象;Shannon多样性指数（I）为0.694，多态性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）为0.354 1，具有较高遗传多样性，遗传变异主要源于群体内;UPGMA聚类图以0.692为阈值，可以将105个单株分为4个类群。该研究筛选出的SSR引物具有较好通用性，长白落叶松种子园遗传多样性较高，无性系群体遗传变异水平没有降低。
关键词：长白落叶松;SSR标记;通用性;遗传多样性;聚类分析
中图分类号：S791.22 文献标识码：A 文章编号：1006-8023（2022）03-0016-10
Genetic Diversity Analysis of Larix olgensis Clone Seed Orchards
QIU Xinyu， ZHANG Lei， ZHANG Hanguo*， YAN Pingyu
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）
Abstract：In order to understand the genetic diversity and change trend of Larix olgensis production groups， and to provide scientific basis for collection， protection and multi-generation genetic improvement of L. olgensis excellent breeding resource， 30 pairs of primers with high polymorphism were selected from 270 pairs of Pinaceae SSR universal primers， and 105 individual plants of L. olgensis seed orchard in Linkou Qingshan forest farm were analyzed by SSR molecular markers. The results showed that a total of 258 pairs of alleles were detected with 30 pairs of primers， the average number of observed alleles （Na） was 2.833， the average number of effective alleles （Ne） was 1.814， the average observed heterozygosity （Ho） was 0.404， and the average expected heterozygosity （He） was 0.401. The inbreeding coefficient in population （Fis） and total inbreeding coefficient in population （Fit） were negative， indicated a slight heterozygote excess and no inbreeding decline. The Shannon diversity index （I） was 0.694， and the polymorphism information content （PIC） was 0.354 1， exhibited a high genetic diversity and genetic variation was mainly within the population. The UPGMA cluster diagram took 0.692 as the threshold and divided the 105 individual plants into four groups. The SSR primers for this study have good versatility， the genetic diversity of L. olgensis seed orchard is high， and the genetic variation level of clonal population is not reduced.D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
Keywords：Larix olgensis; SSR; transferability; genetic diversity;clustering analysis
0 引言
长白落叶松（Larix olgensis）为松科（Pinaceae）落叶松属（Larix）落叶乔木，是我国优良的速生用材、纸浆材树种，也是東北地区森林更新和荒山造林的主要树种之一[1]，且因其树干通直、圆满，木材耐腐、 耐湿，具有生长迅速、适应性强和分布广等特点，是电业、煤矿、造船、桥梁和铁路等方面的优良用材[2]，保存并延续其优良性状一直是科研人员的研究重点。建立种子园是有效提高树木种实遗传品质的根本途径之一。种子园指由优树无性系或家系建立起来的，以生产优质种实为目的的林地。优树是从条件相似、林龄相同或相近的同种天然林或人工林中选拔出来的表型优良树木个体，优树无性系指优树嫁接苗、扦插苗和组织培养苗等繁殖材料，优树家系指由优树自由授粉或控制授粉后所形成的繁殖材料。种子园既要获得较高的遗传增益，又必须保持较宽的遗传基础[3]，但是作为种子园亲本群体的优树基因库是有限的，加之还需在一定条件下选育，很大比例的天然群体将被淘汰，从而造成其遗传基础过窄，多样性流失，在育种群体和生产群体中往往出现近交和共祖现象，近交使其适应力降低，随着遗传改良力度加大，遗传基础会越来越窄，阻碍遗传改良活动长久开展[4]。当前，种子园遗传基础过窄是林木多世代改良中最值得关注的问题，在分子水平上对其遗传多样性水平和群体结构进行科学分析和评价十分必要。
随着生物技术不断发展，分子标记成为生物信息学最重要的研究手段之一，利用分子标记技术可以实现物种各群体遗传学参数和亲缘关系的快速分析[5]。简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）是以PCR技术为核心的DNA分子标记技术，或称微卫星序列标记（Microsatellite Sequence，MS），在落叶松属植物遗传分析和基因型分析中得到广泛应用[6]。何清伟[7]利用20对SSR分子标记选出的华北落叶松（Larix principis-rupprechtii）和长白落叶松优树群体拥有相对较宽的遗传参数变化范围;董明亮[8]利用新开发的SSR标记得出华北落叶松种子园的遗传多样性处于中等水平;贯春雨等[9]利用RAPD、SSR分子标记得到日本落叶松（Larix kaempferi）×兴安落叶松（Larix gmelinii）杂种F1代群体遗传多样性水平各指数基本一致的结论;于大德[10]利用10对SSR引物揭示出华北落叶松种子园亲子代之间遗传多样性没有显著变化，并认为在后续育种工作中可继续进行高世代优树选择，不必过度担心遗传多样性降低。上述研究结果为落叶松遗传改良提供了理论依据，并为落叶松资源高效利用奠定了基础。
相较阔叶树种而言，基因组较大、DNA序列缺乏的针叶树种多样性研究较为滞后，主要是缺乏有效的分子标记，尤其是多态性好、通用性高的共显性标记。由于微卫星序列侧翼有相当保守的DNA序列，使得微卫星引物具有较高的通用性，因此在同一物种间或物种亲缘关系较近的物种间，甚至分类地位很近的物种间，可以利用引物序列的通用性进行遗传学研究[4]。物种间所开发的SSR标记或许可以作为可参考的重要标记来源，并能够显著降低SSR标记开发成本，但关于落叶松SSR标记开发的研究比起模式植物和其他物种相对较少。Zhang等[11]利用74条含有兴安落叶松SSR的序列设计45对SSR引物，在日本落叶松、华北落叶松和长白落叶松中均成功进行了跨物种扩增;刘超等[12]利用1 788个日本落叶松SSR位点设计500对引物，随机合成102对，以红豆杉科（Taxaceae）、柏科（Cupressaceae）、松科材料为模板进行通用性检测，结果显示扩增率均在70%以上，并利用101对SSR引物对7种不同落叶松品种亲缘关系进行了分析。以上研究表明，不同松科植物间的SSR引物具有良好的通用性。本研究从270对松科SSR通用引物中筛选出多态性高的30对引物，利用SSR分子标记对林口县青山林场长白落叶松种子园105个单株进行遗传分析，以期了解长白落叶松生产群体的遗传多样性及其变化趋势，为落叶松优良种质资源收集、保护和多世代遗传改良提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料来源于黑龙江省林口县青山林场长白落叶松无性系种子园，无性系亲本采自小北湖林场天然母树林，1994年定植，于第78区采取105株无性系单株。样本采用当年生幼嫩针叶，分袋标记，冰袋运输至实验室-80 ℃冷冻保存。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA提取
使用北京天根生化科技有限公司生产的DNA试剂盒提取样品总DNA，并采用1.5%琼脂糖凝胶电泳对其进行检测，如图1所示，DNA条带清晰明亮，无拖尾弥散。利用Micro Drop超微量分光光度计测得质量浓度均在100 mg/mL以上，A260/A280为1.8～2.0（核酸纯度的指示值，纯净的DNA样品A260/A280大于1.8，如果比值低于1.8，表示存在蛋白质或酸类物质的影响），DNA质量满足后续试验要求。将DNA质量浓度稀释至相同浓度20 mg/mL备用。
1.2.2 引物筛选
对已发表的松科SSR引物进行筛选，得到火炬松（Pinus taeda）[13-14]、美国白皮松（Pinus albicauli）[15]、大别山五针松（Pinus dabeshanensis）[16]、华山松（Pinus armandii）[17]、红松（Pinus koraiensis）[18]、马尾松（Pinus massoniana）[19]、毛枝五针松（Pinus wangii）[20]、日本落叶松[12，21-22]、华北落叶松[6]和兴安落叶松[23-24] 10个物种共计270对SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，随机选取5个样本DNA对合成引物进行初步筛选，并用3%琼脂糖凝胶进行目的条带检测，二次筛选用40个样本DNA对可扩增出目的条带的引物进行多态性筛选，并用8%聚丙烯酰胺凝胶进行目的条带检测，进一步筛选获得30对多态性高、重复性好的引物用于遗传多样性分析。D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
1.2.3 SSR-PCR反应体系和扩增程序
以长白落叶松基因组DNA为模板，SSR-PCR反应体系和扩增程序参照姚宇的研究方法[4]进行优化。反应体系和扩增条件见表1和表2。
1.2.4 PCR产物电泳检测
基于SSR-PCR反应体系和扩增程序对长白落叶松105个单株基因组DNA进行PCR擴增，所得PCR产物利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，500 bp DNA Marker作为已知分子量的DNA标准样品，使用1×TBE电泳缓冲液，设定恒压200 V，电泳1.5 h，银染法染色，在凝胶成像仪下成像。
1.2.5 数据统计与分析
对于电泳图谱中的多态位点，每个SSR标记只统计目标片段范围内的条带，重复试验中稳定出现的差异带用于数据分析，按照片段由上到下顺序，根据DNA标准样品在凝胶上的指示位置，估计DNA样品扩增产物的分子量大小，有带记为1，无带记为0。利用GenAlex 6.41、Popgen 32、Power marker和NTSYS-pc 2.10聚类软件计算遗传多样性参数，包括观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）以及Shannon多样性指数（I）;运用Power marker软件计算群体多态性信息含量（PIC）;利用NTSYS-pc 2.10软件构建UPGMA聚类图;使用Structure 2.3.1软件估计最佳群体群组数K值，并将数据上传至Structure 2.3.1 Harvester软件进行分析。GenAlex 6.41和Power marker利用位置与同一泳道GL500分子内标进行比较，得出SSR扩增产物长度进行计算，Popgen 32和NTSYS-pc 2. 10利用0-1二进制数据进行计算。引物通用率和多态性引物率计算公式如下：
引物通用率（%）=有扩增产物的引物对数/通用性检测的引物对数×100。
多态性引物率（%）=扩增出多态条带的引物对数/有扩增产物的引物对数×100[25]。
2 结果与分析
2.1 引物质量分析
2.1.1 引物通用性分析
利用270对SSR引物对长白落叶松105个单株进行PCR扩增，不同引物扩增得到的谱带长度明显不同，标记产物大小范围为100～300 bp。108对引物可扩增出条带，通用率为40.00%，50对引物具有多态性，多态性引物率为46.30%，不同树种SSR引物在长白落叶松无性系中的通用性检测结果见表3。与长白落叶松同为落叶松属的20对华北落叶松引物，有19对在长白落叶松无性系中扩增出目的条带，通用率为95.00%，其中有14对引物在长白落叶松无性系中检测到多态性，多态性引物率为73.68%，而日本落叶松、兴安落叶松分别有48对、7对引物在长白落叶松无性系中扩增出目的条带，通用率分别为67.16%、28.00%，分别有30对、1对引物在长白落叶松无性系中检测到多态性，多态性引物率分别为62.50%、14.28%。与长白落叶松亲缘关系较远的松属的大别山五针松、华山松、红松分别有4对、5对、12对引物在长白落叶松无性系中扩增出目的条带，通用率分别为25.00%、14.70%、34.29%，分别有1对、1对、3对引物在长白落叶松无性系中检测到多态性，多态性引物率分别为25.00%、20.00%、25.00%。比较下来，落叶松属的引物通用率明显高于松属，说明SSR引物在落叶松属中具有很好的普适性，在亲缘关系相近的物种间可以共享同一SSR标记。
2.1.2 引物多态性分析
通过对引物通用性和稳定性的验证，华北落叶松筛选出D2-D19[6]，日本落叶松筛选出RH1-RH8、RL2-RL11、RQ3-RQ10[11]，共30对SSR引物，对基因组DNA进行PCR扩增发现，在扩增带类型、扩增带数量和多态性检出率等方面存在差异，简单重复序列位点多态性分析结果见表4（以GenAlex 6.41计算为准）。30对引物共检测到258对等位基因，每个位点的观测等位基因数2～4个，平均观测等位基因数（Na）为2.833，平均有效等位基因数（Ne）为1.814，平均观测杂合度（Ho）为0.404，平均期望杂合度（He）为0.401，其中RQ4引物检测到的等位基因数最多，Ne和He最大（分别为3.297和0.697），Shannon多样性指数（I）最高（1.291）;RQ3位点的Ne和He最小（分别为1.100和0.091），Shannon多样性指数（I）最低（0.191）。平均Shannon多样性指数（I）为0.694，平均PIC为0.354 1，其中PIC<0.25的位点有7个，为低度多态性位点;0.25
通常，种群内近交系数（Fis）代表观测杂合度与期望杂合度之间的偏差程度，对群体交配系统具有重要意义[26]。根据Wright（1978）[27]关于Fis的计算公式：Fis=1-Ho/He，当Fis小于0时，则Ho>He，表明远交产生的杂合体过多，出现杂合子过剩;当Fis大于0时，则HoSymbol|@@ He，表明近交产生的纯合个体较多，出现纯合子过剩。30个SSR位点的F统计量检测结果显示，Fis、Fit（群体总近交系数）分别为-0.049和-0.031，均为负值，群体表现出轻微杂合子过量，纯合子不足，未出现近交衰退现象;基因流Nm平均值为286.232，远高于自然群体，说明群体基因稳定性较低，基因交流频繁;根据公式Nm=0.25（1-Fst）/Fst可知，每代迁入的有效个体数与群体间遗传差异水平成反比，群体越稳定，度量群体间遗传差异程度的Fst越大[28]，群体间遗传分化系数Fst平均值为0.018，可见群体间遗传分化程度较小。D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
2.2 不同统计方法遗传多样性分析
采用不同统计方法分析遗传多样性差异，GenAlex 6.41、Popgen 32、Power marker软件计算所得平均观测等位基因数（Na）均为2.833，平均有效等位基因数（Ne）基本一致，平均观测杂合度（Ho）Popgen 32略高于GenAlex 6.41，但平均期望杂合度（He）和平均Shannon多样性指数（I）差异很小，平均Nei基因多样性指数（H）则完全相同（表5）。利用SPSS统计软件计算分析其差异是否显著，平均观测杂合度（Ho）符合正态分布，配对样本t检验计算P值均小于0.05，平均期望杂合度（He）的P值以及平均Shannon多样性指数（I）均为0，平均有效等位基因数（Ne）不符合正态分布，配对样本的秩和检验计算得到P值为1，说明不同遗传多样性分析软件的计算结果差异微小，本研究试验数据具有较高可信度。
2.3 聚类分析
为进一步分析其中的亲缘关系，根据长白落叶松种子园105个单株的遗传一致度构建长白落叶松UPGMA聚类图。如图4所示，以0.692为阈值，可将105单株分为4个类群。105个单株间遗传相似系数为0.518 5～0.923 1，平均遗传相似度为0.720 4，遗传距离为0～0.656 7，平均遗传距离为0.336 8，说明选取的长白落叶松单株在分子水平上具有一定差异，其遗传多样性较丰富。长白落叶松105个单株中，第9单株与第72单株之间的遗传相似度最小（0.518 5），遗传距离最大（0.656 7），说明二者之间的遗传差异最大。
2.4 群体遗传结构分析
对长白落叶松种子园生产群体进行遗传结构分析可知，lnP（D）随着K值增加逐渐降低，lnP（D）在K=4时出现第1个转折点，此时ΔK为最大值，如图5所示，根据似然数最大原则确定最佳群体数目[29]，可将105个单株分为4个理论群组，意味着长
白落叶松种子园105个单株分化为4个不同基因型族。如图6所示，横坐标表示105个单株，纵坐标表示Q分布，长白落叶松被划分为4亚群体：第一亚群包括单株25、84和27，第二亚群只包括单株89，第三亚群包括单株7、9、12、31、32、37、55、61、67、79、80、90，其余为第四亚群。
3 讨论与结论
不同遗传材料重复次数的可变性，导致SSR长度的高度变异性，这一变异性正是微卫星变异的实际遗传基础。物种之间DNA序列的同源性，使得不同物种间转移使用SSR引物成为可能，已有试验证明同科不同属或更近物种间可共用某些SSR引物[30]。从近缘物种270对引物中筛选出108对引物，可以在40个长白落叶松无性系中成功扩增，通用率为40.00%，落叶松属112对引物中有效引物45对，多态性引物率高达60.81%，松属158对引物通用率为21.52%，多态性引物率为14.71%，其中与长白落叶松同为落叶松属的华北落叶松、日本落叶松、兴安落叶松引物通用率分别为95.00%、67.16%、28.00%，多态性引物率引物率分别为73.68%、62.50%、14.28%。这些引物几乎在所有供试材料上均能扩增出与目的条带大小相似的产物，但不同属间SSR引物揭示的多态性水平不尽相同，表明本研究筛选的SSR引物表现出较高的通用性和多态性，属间通用引物成功率主要依赖于属间亲缘关系远近，与刘超等[12]开发的落叶松引物通用性检测结果一致。本试验筛选出30对有效引物，其中RQ4等位基因数最多，Ne和He最大，RQ3相比之下较低，也验证了不同属SSR引物虽然跨属间高度扩增，但多态性水平存在差异。一个标记系统的交叉转移程度决定其在其他遗传研究中的适用性，应用多种DNA标记方法有助于从长白落叶松全基因组组织分化角度，更准确揭示长白落叶松的系统发育关系。本研究筛选的多态性SSR引物，特异性强且稳定性较好，对于目前只有少量SSR引物公布的落叶松属树种来说，丰富了现有分子标记资源，有助于落叶松属种群遗传结构、品种指纹图谱构建以及种质鉴定等研究领域进一步发展，尤其对分析遗传背景较近的资源意义重大。
从多种遗传多样性软件计算得到的数据可以看出，每个位点的观测等位基因数2～4个不等，平均观测等位基因数（Na）均为2.833，有效等位基因数（Ne）为1.737 0～1.815 7，观测杂合度（Ho）为0.383 0～0.617 3，期望杂合度（He）为0.371 0～0.404 4，Shannon多样性指数（I）为0.654 0～0.693 9，平均PIC为0.354 1，说明种子園遗传多样性较高，无性系遗传多样性也未降低。姚宇[4]利用SSR分子标记对林口青山种子园38个长白落叶松无性系亲代与子代遗传多样性进行分析，子代群体和亲代群体的Shannon多样性指数（I）分别为1.023 2和0.980 5，比本试验利用30对SSR引物研究77区和78区共105个单株的遗传多样性（0.673）高，与长白落叶松种子园77区347个单株的ISSR遗传多样性相比，平均Shannon多样性指数（I）略高于单株的0.436，分析其原因可能是长白落叶松无性系种子园存在部分砧木存活等情况，下一步将利用分子标记手段对种子园内无性系进行鉴定分析，也可能是不同数据统计方法存在一定误差。与范英明[31]得到的20个华北落叶松天然群体的平均Shannon多样性指数（0.787）相比，差异不明显，说明种子园的无性系遗传多样性高。
在进行遗传多样性分析时，遗传距离是反映遗传变异水平和遗传分化程度的重要指标，可为杂种优势提供基本遗传参数[32-33]。长白落叶松种子园105个单株的平均遗传相似度为0.720 4，平均遗传距离为0.336 8，说明其存在一定程度的遗传差异。华北落叶松20个天然群体的平均遗传距离为0.035 3[32]，日本落叶松无性系种子园按5个种源计算的遗传距离为0.002～0.015[34]，长白落叶松种子园单株之间的遗传距离与种源之间相比明显要高得多。且从Structure 2.3.1的分析结果将其归为4个类群，说明种子园的遗传组成存在明显差异，长白落叶松种内遗传分化比较广泛，无性系遗传多样性丰富，进一步表明种子园遗传多样性高，无性系分布配置合理。在后续的育种工作中，可以参考胡立平等[35]对长春长白落叶松种子园子代测定的方法，进一步研究林口青山长白落叶松种子园遗传增益与遗传多样性的平衡点，有利于长白落叶松高轮次遗传改良的发展，为营建多世代种子园奠定基础。D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
【参 考 文 献】
[1崔海涛，张玲敏，高庆才，等.长白落叶松形态特征与生物学特性[J].现代农业科技，2012（7）：212.
CUI H T， ZHANG L M， GAO Q C， et al. Morphological and biological characteristics of Larix olgensis[J]. Modern Agricultural Science and Technology， 2012（7）： 212.
[2]郑重.长白落叶松良种选育研究的方法与现状[J].森林工程，2002，28（3）：3-4.
ZHENG Z. Method and status of good breeding study in Larix olgensis[J]. Forest Engineering， 2002，28（3）： 3-4.
[3]李义良，赵奋成，张应中，等.分子标记在松树遗传与进化研究中的应用[J].分子植物育种，2009，7（5）：1004-1009.
LI Y L， ZHAO F C， ZHANG Y Z， et al. Applications of molecular marker on the research of pine genetics and evolution[J]. Molecular Plant Breeding， 2009， 7（5）： 1004-1009.
[4]姚宇.长白落叶松初级无性系种子园SSR遗传多样性分析[D].哈尔滨：东北林业大学，2013.
YAO Y. Genetic diversity of a Larix olgensis henry seed orchard using SSR markers[D]. Harbin： Northeast Forestry University， 2013.
[5]卢萬鸿.尾叶桉多世代育种群体的遗传多样性及其改良性状的关联分析[D].北京：中国林业科学研究院，2017.
LU W H. Genetic diversity of multi-generation breeding population and association analysis of interested traits in Eucalyptus urophylla[D]. Beijing： Chinese Academy of Forestry， 2017.
[6]董明亮，高嘉玥，孙文婷，等.北京市华北落叶松优树群体遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报，2016，17（4）：616-624.
DONG M L， GAO J Y， SUN W T， et al. Genetic diversity and population structure of elite Larix principis-rupprechtii Mayr. in Beijing[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2016， 17（4）： 616-624.
[7]何清伟.两种落叶松优良种质选择及其分子遗传分析[D].北京：北京林业大学，2020.
HE Q W. Selection and molecular genetic analysis of excellent germplasm of two larch species[D]. Beijing： Beijing Forestry University， 2020.
[8]董明亮.华北落叶松高密度遗传连锁图谱构建及重要性状QTL分析[D].北京：北京林业大学，2020.
DONG M L. High-density genetic linkage map construction and QTL analysis of phenotypic traits in Larix principis-rupprechtii Mayr.[D]. Beijing： Beijing Forestry University， 2020.
[9]贯春雨，张含国，张磊，等.落叶松杂种F1代群体遗传多样性的RAPD、SSR分析[J].经济林研究，2010，28（4）：8-14.
GUAN C Y， ZHANG H G， ZHANG L， et al. RAPD and SSR analysis of genetic diversity of hybrid F1 progeny population in Larix spp[J]. Nonwood Forest Research， 2010， 28（4）： 8-14.
[10]于大德.华北落叶松种子园遗传多样性及亲本分析[D].北京：北京林业大学，2014.
YU D D. Genetic diversity and parental analysis of seed orchard of Larix prindpis-rupprechtii Mayr.[D]. Beijing： Beijing Forestry University， 2014.
[11]ZHANG G J， SUN Z Z， ZHOU D， et al. Development and characterization of novel EST-SSRs from Larix gmelinii and their cross-species transferability[J]. Molecules， 2015， 20（7）： 12469-12480.D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
[12]刘超，张力鹏，王春国，等.日本落叶松EST-SSR标记挖掘及特征分析[J].林业科学研究，2013，26（F10）：60-68.
LIU C， ZHANG L P， WANG C G， et al. Development and characterization of EST-SSR molecular markers in Larix kaempferi[J]. Research of Forest Sciences， 2013， 26（F10）： 60-68.
[13]ECHT C S， SAHA S， DEEMER D L， et al. Microsatellite DNA in genomic survey sequences and UniGenes of loblolly pine[J]. Tree Genetics & Genomes， 2011， 7（4）： 773-780.
[14]LIEWLAKSANEEYANAWIN C， RITLAND C E， EL-KASSABY Y A， et al. Single-copy， species-transferable microsatellite markers developed from loblolly pine ESTs[J]. TAG Theoretical and Applied Genetics， 2004， 109（2）： 361-369.
[15]LEA M V， SYRING J， JENNINGS T， et al. Development of nuclear microsatellite loci for Pinus albicaulis Engelm. （Pinaceae）， a conifer of conservation concern[J]. PLoS One， 2018， 13（10）： e0205423.
[16]XIANG X Y， ZHANG Z X， WANG Z G， et al. Transcriptome sequencing and development of EST-SSR markers in Pinus dabeshanensis， an endangered conifer endemic to China[J]. Molecular Breeding， 2015， 35（8）： 1-10.
[17]DONG W L， WANG R N， YAN X H， et al. Characterization of polymorphic microsatellite markers in Pinus armandii （Pinaceae）， an endemic conifer species to China[J]. Applications in Plant Sciences， 2016， 4（10）： 1600072.
[18]张振，张含国，莫迟，等.红松转录组SSR分析及EST-SSR标记开发[J].林业科学，2015，51（8）：114-120.
ZHANG Z， ZHANG H G， MO C， et al. Transcriptome sequencing analysis and development of EST-SSR markers for Pinus koraiensis[J]. Scientia Silvae Sinicae， 2015， 51（8）： 114-120.
[19]倪州獻，白天道，蔡恒，等.马尾松基因组SSR标记在松属其他树种中的通用性分析[J].分子植物育种，2015，13（12）：2811-2817.
NI Z X， BAI T D， CAI H， et al. The Transferability of Pinus massoniana SSR in other Pinus species[J]. Molecular Plant Breeding， 2015， 13（12）： 2811-2817.
[20]DOU J J， ZHOU R C， TANG A J， et al. Development and characterization of nine microsatellites for an endangered tree， Pinus wangii （Pinaceae）[J]. Applications in Plant Sciences， 2013， 1（2）： 1200134.
[21]杨秀艳，孙晓梅，张守攻，等.日本落叶松EST-SSR标记开发及二代优树遗传多样性分析[J].林业科学，2011，47（11）：52-58.
YANG X Y， SUN X M， ZHANG S G， et al. Development of EST-SSR markers and genetic diversity analysis of the second cycle elite population in Larix kaempferi[J]. Scientia Silvae Sinicae， 2011， 47（11）： 52-58.
[22]CHEN X B， XIE Y H， SUN X M. Development and characterization of polymorphic genic-SSR markers in Larix kaempferi[J]. Molecules， 2015， 20（4）： 6060-6067.
[23]ZHANG Z， ZHANG H G， DU J， et al. Rapd and SSR analysis of genetic diversity of natural Larix gmelinii populations[J]. Biotechnology & Biotechnological Equipment， 2013， 27（4）： 3959-3965.D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
[24]贯春雨，张含国，张磊，等.基于松科树种EST序列的落叶松SSR引物开发[J].东北林业大学学报，2011，39（1）：20-23.
GUAN C Y， ZHANG H G， ZHANG L， et al. Development of Larix lep SSR primers from EST sequence of Pinaceae family[J]. Journal of Northeast Forestry University， 2011， 39（1）： 20-23.
[25]王紫阳，成彦丽，殷云龙，等.中山杉EST-SSR引物通用性及基因分型检测[J].分子植物育种，2015，13（7）：1631-1638.
WANG Z Y， CHENG Y L， YIN Y L， et al. The cross-family transferability of SSR markers developed from the transcriptome of Taxodium ‘Zhongshanshan 406 and its application in genotypic assessment[J]. Molecular Plant Breeding， 2015， 13（7）： 1631-1638.
[26]于大德，袁定昌，张登荣，等.华北落叶松种子园不同世代间遗传多样性变化[J].植物遗传资源学报，2014，15（5）：940-947.
YU D D， YUAN D C， ZHANG D R， et al. Genetic diversity of Larix principis-rupprechtii Mayr. seed orchard among generations[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2014， 15（5）： 940-947.
[27]冯源恒，吴东山，王德俊，等.拉雅松遗传多样性及同域分布种间亲缘关系分析[J].广西植物，2014，34（3）：320-325.
FENG Y H， WU D S， WANG D J， et al. Analysis of the relationship between genetic diversity and peer distribution of Pinus crassicorticea[J]. Guangxi Plant， 2014， 34（3）： 320-325.
[28]高源，王昆，王大江，等.7个来源地区山荆子的遗传多样性与群体结构分析[J].中国农业科学，2018，51（19）：3766-3777.
GAO Y， WANG K， WANG D J， et al. The genetic diversity and population structure analysis on Malus baccata （L.） Borkh. from 7 sources[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2018， 51（19）： 3766-3777.
[29]辛静，高丽云，徐剑，等.基于SSR标记的紫溪山华山松种子园无性系遗传多样性分析[J].云南农业大学学报（自然科学），2021，36（5）：898-904.
XIN J， GAO L Y， XU J， et al. SSR markers analysis of genetic diversity in Pinus armandii clones from seed orchard in Zixi Mountain[J]. Journal of Yunnan Agricultural University （Natural Science）， 2021， 36（5）： 898-904.
[30]韓骞，王辉，王进茂，等.利用SSR引物通用性分析杨柳科树种遗传多样性[J].分子植物育种，2009，7（5）：904-911.
HAN Q， WANG H， WANG J M， et al. Genertic diversity analysis of Salicaceae cultivars by transferablity of SSR primers[J]. Molecular Plant Breeding， 2009， 7（5）： 904-911.
[31]范英明.华北落叶松天然群体SSR标记遗传多样性分析[D].北京：北京林业大学，2014.
FAN Y M. Genetic diversity of Larix principis-rupprechtii revealed by SSR marker[D]. Beijing： Beijing Forestry University， 2014.
[32]睢鑫洲，郑毅，仇玉萍，等.4个西南桦品系的遗传多样性分析[J].西南林业大学学报（自然科学），2017，37（3）：21-25.
SUI X Z， ZHENG Y， QIU Y P， et al. Genetic diversity of 4 Betula alnoides[J]. Journal of Southwest Forestry University （Natural Sciences）， 2017， 37（3）： 21-25.
[33]赵祜，吕东，刘贤德，等.基于球果和种子的青海云杉无性系表型性状多样性研究[J].中南林业科技大学学报，2020，40（11）：39-46，99.
ZHAO H， LYU D， LIU X D， et al. Phenotypic diversity of Picea crassifolia clones based on cones and seeds[J]. Journal of Central South University of Forestry & Technology， 2020，40（11）：39-46，99.
[34]杜超群，许业洲，孙晓梅.日本落叶松种子园群体遗传多样性评价[J].森林与环境学报，2020，40（4）：406-411.
DU C Q， XU Y Z， SUN X M. Genetic diversity evaluation of Larix kaempferi population in seed orchard[J]. Journal of Forest and Environment， 2020， 40（4）： 406-411.
[35]胡立平，毛辉.长白落叶松第二代种子园子代测定技术[J].森林工程，2007（4）：16-17，24.
HU L P， MAO H. The second generation of seed garden generation measurement technology of Larix olgensis[J]. Forest Engineering， 2007（4）： 16-17，24.D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
