基于过敏性疾病和健康儿童的淋巴细胞精细分型病例对照研究

韩玲丽 卜华琴 刘璐瑶 曾玉媛 姚海丽 王晓川 孙金峤

T、B细胞在过敏性疾病的发生中发挥重要作用。其中Th1/Th2失衡是目前公认并研究较为深入的调控食物过敏的机制，Th2细胞在过敏性疾病的发生中起启动作用，可分泌IL-4、IL-9等细胞因子，促进B细胞分化为浆母细胞并发生类别转换产生IgE抗体，而IgE抗体可促使嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面FcεRI交联，使得胞内产生组胺等炎症介质产生，促进过敏的发生[1-3]。而近年来发现IgE+长寿浆细胞和记忆B 细胞的存在可能是过敏性疾病持续甚至延续终生的主要原因[4-6]。尽管T、B细胞在过敏性疾病中的机制研究较为深入，但关于过敏儿童淋巴细胞精细分型特征研究较少。本研究对过敏儿童和正常健康儿童行T/B淋巴细胞检测并做精细分型，期望对临床诊断过敏性疾病提供新的标志物。

1 方法

1.1 过敏性疾病组纳入标准 纳入2021年3～11月于复旦大学附属儿科医院(我院)临床免疫科就诊的过敏性疾病(食物过敏或呼吸道过敏)，且年龄>28 d的患儿。食物过敏：有明确的某项食物摄入后过敏反应病史，回避过敏原症状缓解，结合实验室检查(嗜酸性粒细胞绝对计数、总IgE及血清特异性IgE检测)确诊；呼吸道过敏：呼吸道过敏症状(如咳嗽、鼻痒、喘息等)，结合实验室检查(嗜酸性粒细胞绝对计数、总IgE及血清特异性IgE检测)确诊。

1.2 健康对照组纳入和排除标准 ①与过敏性疾病组同时期在我院体检正常且年龄>28 d儿童；②性别和年龄与过敏性疾病组匹配；③排除有过敏疾病史和其他疾病史。

1.3 淋巴细胞精细分型检测

1.3.1 外周血单个核细胞分离 1 mL新鲜外周血与等体积磷酸盐缓冲液(PBS)在15 mL离心管中混匀，缓慢将1 mL ficoll加入管底，2 000 rpm离心20 min。取中间白膜层至新的离心管，加入10 mL PBS洗去ficoll，1 mL PBS重悬，计数板计数，分别取5×105个细胞用于T/B细胞流式染色。

1.3.2 T和B淋巴细胞流式细胞术检测 5×105个外周血单个核细胞标记抗体(PerCP5.5 anti-human CD3, FITC anti-human CD4, PE-Cy7 anti-human-CD45RA, PE anti-human-CCR6, APCanti-human-CCR4, Brilliant Violet 421TManti-human-CXCR3 Biolegend)，用于检测Th1(T helper 1 cells CD3+CD4+CD45RA-CCR6-CCR4-CXCR3+)和Th2 (T helper 2 cells CD3+CD4+CD45RA-CCR6-CCR4+CXCR3-)。

另取5×105个外周血单个核细胞标记抗体(Brilliant Violet 605TManti-human CD19，PE/Cyanine7 anti-human CD21，FITC anti-human CD38， Brilliant Violet 421TManti-human CD27，PerCP/Cyanine5.5 anti-human IgM，Brilliant Violet 510TManti-human IgD，APC anti-human IgE Biolegend)用于检测成熟B细胞(CD19+CD21+)。IgE+浆母细胞(CD19+CD21+CD38highIgM-IgD-IgE+)和IgE+记忆B细胞(CD19+CD21+CD38dimIgD-IgM-IgE+CD27-和CD19+CD21+CD38dimIgD-IgM-IgE+CD27+)。

用BECKMAN CytoFLEX Quanta收集4×104～2×105个细胞，流式结果用FlowJo_V10分析。

1.4 其他实验室检查 全自动血液分析仪检测嗜酸性粒细胞绝对计数、UniCAP诊断系统检测外周血总IgE浓度、ImunnoCAP(Thermo Phadia 250)诊断系统检测血清特异性IgE浓度。

1.5 统计学分析 数据结果采用Graphpad Prism统计分析，计量资料以xˉ±s表示，组间比较采用t检验，率的比较采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 符合本文纳入和排除标准的过敏性疾病患儿30例，男19例，女11例，平均年龄3.6(0.7～10.6)岁，总IgE 631.9(23.9～3 043.2) kU·L-1，嗜酸性粒细胞绝对计数(548.9 ± 57.7)个/μL。健康对照组27名，男19名，女8名，平均年龄4.1 (0.8～11) 岁，嗜酸性粒细胞绝对计数(110.8±18.9)个/μL。两组年龄、性别差异无统计学意义(P分别为0.616和0.574)。

2.2 过敏性疾病组儿童临床表现 食物过敏16例，男10例，女6例，主要临床表现为湿疹和特应性皮炎；过敏原：鸡蛋81.3%，牛奶58.8%，花生31.3%，小麦25.0%，大豆12.5%，芝麻6.2%。呼吸道过敏14例，男9例，女5例，主要临床表现为过敏性咳嗽、过敏性鼻炎和哮喘；过敏原：尘螨92.3%，真菌23.1%，动物皮屑15.4%。

2.3 T淋巴细胞亚群 图1和表1显示，过敏性疾病组与健康对照组CD3 T细胞绝对计数、CD4 T细胞比例、CD4 T细胞绝对细胞计数、Th1细胞比例差异无统计学意义，过敏性疾病组Th2细胞占效应辅助T细胞比例和Th2/Th1比值高于健康对照组，差异均有统计学意义。

2.4 B淋巴细胞亚群 表1和图2显示，过敏性疾病组成熟B细胞比例及绝对计数、浆母细胞绝对计数、IgE+浆母细胞比例、IgE+记忆B细胞比例高于健康对照组，差异均有统计学意义。

表1 过敏性疾病儿童和健康对照儿童淋巴细胞亚群检测情况比较

3 讨论

近几十年来，过敏性疾病的发生率日益增长，已经成为全球关注的焦点问题[7-10]。IgE介导是过敏性疾病发生的主要机制，而IgE的产生依赖于发生类别转换后的浆母细胞，IgE+记忆B细胞可增殖分化不断补充生成新的IgE+浆母细胞，这或为过敏性疾病持续终生的主要原因[4, 5, 11, 12]。临床上，过敏性疾病的诊断缺乏明确的检测标准，主要依赖于病史，而过敏缓解期，在无过敏原刺激情况下，患者无临床症状，诊断更加困难。因此，本研究比较分析了过敏儿童淋巴细胞亚群特征，为辅助诊断过敏提供新的标志物依据。

本研究共纳入30例过敏儿童和27名健康对照儿童。T细胞流式精细分型结果发现尽管总T细胞、CD4辅助性T细胞绝对计数过敏儿童和健康对照差异无统计学意义，然而过敏儿童Th2细胞占效应辅助性T细胞比例均较对照明显增高，且Th2/Th1比值过敏儿童也明显高于健康对照，表明过敏儿童体内存在Th2极化。而B淋巴细胞精细分型比较发现，过敏儿童成熟B细胞比例、成熟B细胞和浆母细胞绝对计数均高于健康对照，IgE+浆母细胞和IgE+记忆B细胞比例较对照也明显增高，上述结果表明过敏儿童T、B淋巴细胞精细分型与健康对照存在明显差异。尽管本研究样本量偏少，但对临床诊断过敏性疾病的诊断及鉴别诊断仍有部分提示意义，丰富了过敏儿童T、B淋巴细胞表型。

目前研究认为婴幼儿期起始的食物过敏和后续可以持续终生的呼吸道过敏如过敏性鼻炎、哮喘等被认为是一个“过敏接力”过程[7, 8, 13]。尽管Th1/Th2失衡机制可解释大多数过敏性疾病的发生发展，然而却无法解释早期的食物过敏为何会发生过敏原耐受和过渡到呼吸道过敏两种不同的临床转归。而IgE+浆母细胞和IgE+记忆B 细胞的长期存在或可解释食物过敏为何会进展到后续的呼吸道过敏。基于IgE+浆母细胞和IgE+记忆B细胞一旦产生，在体内可长期稳定存活，在过敏缓解期无过敏原刺激情况下IgE+浆母细胞和IgE+记忆B细胞也长期稳定存在于体内，故推测IgE+浆母细胞和记忆B细胞或许可以作为过敏缓解期的诊断指标。

综上所述，过敏儿童和健康对照淋巴细胞精细分型比较结果表明过敏儿童存在Th2细胞比例增高和特异性的IgE+浆母细胞和IgE+记忆B细胞比例增加，可作为辅助诊断过敏性疾病的标志物。IgE+浆母细胞和IgE+记忆B细胞可以辅助过敏缓解期过敏性疾病的诊断。