基于纤突蛋白的鹅星状病毒间接ELISA检测方法的建立

●李清欣 张宇亮 曾杏梅 柴龙会 陈立志 张彦龙※

（1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院 黑龙江 哈尔滨 150040；2.中国农业科学院特产研究所 吉林 长春 130112）

星状病毒（Astroviridae）是一种单股正链RNA病毒，呈现为二十面的对称体，直径为28～33 nm。电子显微镜下表面呈多角凸起，形似星星，故命名为星状病毒[1]。能够感染人、水貂、禽类等，导致腹泻、神经损伤等[2-3]，禽星状病毒还会导致禽肾炎[4-6]。自2016年以来，由鹅星状病毒引起的雏鹅痛风在全国各地鹅养殖场陆续暴发，导致雏鹅大量死亡，给国内养殖业带来经济损失。患病雏鹅临床主要表现为痛风，病理剖检表现为关节、内脏可见尿酸盐沉积。

星状病毒感染细胞后基因组首先指导编码90 kD（VP90）衣壳蛋白前体，可分为3个线性域：保守的N端域，高变域和酸性C端域[7]。保守的N末端结构域，经宿主细胞外蛋白酶的水解产生3种主要蛋白：VP34、VP27/29和VP25/26[8]，其中VP27/29和VP25/26组成二聚体，形成衣壳蛋白上的纤突，是星状病毒的主要抗原识别位点[9]，血清中其抗体的存在能说明鹅星状病毒的免疫和感染情况。

本研究选取鹅星状病毒的ORF2纤突蛋白为抗原，建立间接ELISA血清学检测方法，为鹅及其他动物星状病毒的血清学检测提供借鉴方法。

1 材料与方法

1.1 病毒株和血清

Astv/Goose/Heilongjiang/ZYL02/2019毒株由实验室分离保存；阴性血清、鹅星状病毒阳性血清、小鹅瘟阳性血清、鹅腺病毒阳性血清由实验室保存。

1.2 主要试剂

考马斯亮蓝R-250（上海复申生物科技有限公司）；牛血清白蛋白BSA（上海宝曼生物科技有限公司）；蛋白Marker（北京全式金生物技术公司）；胶回收试剂盒（天根公司）；无内毒素质粒小量抽提试剂盒（OMEGA公司）；T4DNA连接酶、E. coliDH5α、BL21（宝日医生物技术有限公司）；His标签蛋白纯化试剂盒（碧云天公司）；HRP-兔抗鹅酶标二抗（Friendbio公司）。

1.3 引物的设计与合成

根据 NCBI 报道的已知序列（登录号：MN175321），由吉林省库美生物科技有限公司合成扩增纤突蛋白基因序列的引物，GAstVORF2-F：5'-CCGGGATCCCAGGTTACTCCCTCGC TTGT-3'； GAstV-ORF2-R：5'-TGCGTCGACGTCT CGCTCAAGACCTCT-3'。

1.4 纤突蛋白基因的扩增与表达载体的构建

以实验室分离的毒株，用TRIzol法提取病毒总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板用上述引物扩增目的片段并胶回收纯化。获得的目的片段与pCold-TF空载体使用限制性内切酶BamHI和SalI进行双酶切，回收目的片段用T4DNA连接酶链接为完整质粒。构建的重组载体转化至DH5α感受态细胞进行筛选和扩增，内毒素质粒小量抽提试剂盒提取纯化后进行双酶切及PCR验证。确认的扩增载体转化至BL21感受态细胞，挑取平板上生长的单菌落诱导表达。

1.5 重组鹅星状病毒纤突蛋白表达条件优化

按照1∶100的比例从过夜培养的菌液中吸取100 μL加到10 mL液体LB（含AMP）培养基中，放入摇床，37℃，220 r/min培养3 h后（OD600为0.4～0.6），开始诱导。用不同的诱导条件优化：诱导温度分别为16℃，25℃，37℃；诱导时间分别为4，6，16 h；IPTG终浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1 mmol/L，筛选鹅星状病毒纤突蛋白最优表达条件。

1.6 重组纤突蛋白的纯化

按照1∶100的体积比从过夜培养的菌液中吸取100 μL加到10 mL液体LB（含AMP）培养基中，放入摇床，37℃，220 r/min培养3 h，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37℃，220 r/min培养4～6 h。离心收集菌体沉淀，加入30 mL 平衡液，混匀，补加PMSF至终浓度为1 mmol/L，冰浴，超声破碎仪上使菌体破碎至澄清透明。His标签蛋白纯化试剂盒纯化后，SDS-PAGE分析结果。

1.7 抗原最佳包被浓度及血清稀释比的确定

纤突蛋白稀释浓度分别为1，2，4，8，16 μg/mL；鹅阳性血清稀释梯度为1∶200，1∶400，1∶800、1∶1600，按照棋盘法向酶标板加样。4℃包被抗原过夜；PBST洗涤3次，200 μL 5%脱脂奶粉，37℃封闭2 h；PBST洗涤3次，血 清37℃孵育1.5 h；PBST洗涤5次，每孔加入1∶5000倍稀释的HRP-兔抗鹅酶标二抗100 μL，37℃孵育1.5 h；PBST洗涤5次，加入TMB显色液37℃避光显色20 min；加入50 μL终止液，于450 nm读取吸光值。选择P/N值最大的为最佳条件。

1.8 其他反应条件的优化

按照本文“1.7”中选出的抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释度对其他反应条件进行优化。酶标抗体稀释梯度为1∶5000，1∶10 000，1∶15 000，1∶20 000；封闭液分别选择5%脱脂奶粉，5%BSA，1% BSA；封闭时 间 分 别为37℃封 闭1，1.5，2 h；抗原抗体反应的时间分别为30，60，90 min；酶标二抗孵育时间分别为30，60，90 min；抗原的包被时间分别为4℃过夜包被，37℃包被60 min，37℃包被90 min；显色液反应时间分别为显色20 min和显色30 min，每项优化都选择P/N值最大的为最佳条件。

1.9 间接ELISA的Cut-off值的确定

随机采集72份鹅阴性血清，按血清最适比例进行稀释，采用上述建立的最佳反应条件进行间接ELISA试验，读取450 nm吸光值，以X+2SD作为Cut-off值。

1.10 特异性试验

在上述最佳条件下，用小鹅瘟阳性血清和鹅腺病毒阳性血清进行ELISA特异性检测。

1.11 重复性试验

随机选取14份阳性血清和14份阴性血清进行批内和批间重复性试验，每种试验做3组重复，测定450 nm吸光值，计算变异系数。

1.12 敏感性试验

应用上述建立的间接ELISA方法，读取阳性血清从1∶200稀释到1∶102 400稀释的450 nm吸光值，血清稀释度最高的阳性孔的血清稀释倍数为建立的间接ELISA方法的灵敏度。

1.13 临床样品检测

用本研究建立的方法对采集的168份临床雏鹅血清及实验室制备的鹅星状病毒卵黄抗体进行检测。

2 结果

2.1 pCold-TF-rCS 蛋白原核表达载体的构建和鉴定

用PCR进行目的片段的扩增，于735 bp处有特异性条带，与预期大小一致。重组质粒经DH5α感受态细胞扩增后，PCR验证出现同样大小的条带。BamH I和SalI双酶切鉴定，结果在735 bp、5900 bp和5769 bp处有单一条带（图1）。证明挑取的单克隆为成功连接的载体pCold-TF-rCS。

图1 鹅星状病毒纤突蛋白原核表达载体酶切验证

2.2 重组鹅星状病毒纤突蛋白表达条件优化

结果显示，37℃，IPTG终浓度为0.6 mmol/L，诱导表达6 h时重组鹅星状病毒纤突蛋白的表达量最高。

2.3 重组纤突蛋白的纯化

鹅星状病毒纤突蛋白经纯化后获得大小为80.6 kD的重组蛋白，经BCA蛋白浓度测定，表达纯化的纤突蛋白最终浓度为870.83 μg/mL。

2.4 最佳抗原浓度及血清稀释比

按照棋盘法排布抗原及雏鹅血清，结果显示抗原稀释至1 μg/mL，血清按1∶1600稀释时，P/N值最大，因此选择此条件为最佳抗原包被浓度及血清稀释比例。具体结果见表1。

表1 最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释比的结果

2.5 其他反应条件优化结果

结果显示，酶标抗体按1∶5000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000稀释时，P/N的值分别为1.737，1.483，1.393，0.963，酶标抗体按1∶5000稀释时P/N的值最大。

表2结果显示，间接ELISA的最佳封闭液为1% BSA，最佳封闭时间为2 h。

表2 间接ELISA的封闭液及封闭时间优化结果

结果显示，抗原抗体反应30，60，90 min，P/N值分别为6.596，6.960，6.715，因此抗原抗体最佳反应时间为60 min； HRP-兔抗鹅酶标抗体孵育30，60，90 min，P/N值分别为6.348，9.065，8.614，因此HRP-兔抗鹅酶标抗体最佳孵育时间为60 min；抗原分别4℃过夜包被，37℃包被60 min，37℃包被90 min，P/N值分别为7.78，6.462，5.855，因此抗原的最佳包被方式是4℃过夜包被。

根据图2可知，显色20 min与显色30 min在OD450的读数值有差异，但P/N的值接近，不影响判断，因此为节省时间，选择20 min为最佳显色时间。

图2 显色时间优化结果

2.6 间接ELISA的Cut-off值

按照本试验建立的间接ELISA反应流程，对72份鹅星状病毒阴性血清样本进行检测，读取OD450的值。72份阴性样本的OD450的平均值为0.206，标准差为0.046，则Cut-off值为0.298。

2.7 特异性试验结果

对小鹅瘟阳性血清和鹅腺病毒阳性血清进行ELISA检测，结果为阴性，且与阳性读值差异很大，说明建立的检测方法特异性较好。

2.8 重复性试验结果

表3和表4为重复性实验结果。结果显示各变异系数均小于10%，证明建立的间接ELISA方法的重复性良好。

表3 阳性血清重复结果

表4 阴性血清重复结果

2.9 敏感性试验结果

敏感性实验结果说明本研究建立的间接ELISA方法的灵敏度为1∶12 800。

2.10 临床样品检测结果

临床采集的168份雏鹅血清，其中93份检测为阳性，阳性率为55.4%，其中86份OD450的值非常高，为强阳性。实验室制备的鹅星状病毒卵黄抗体检测结果呈阳性。

3 讨论

目前，全球范围内都出现了星状病毒感染的病例，禽星状病毒的感染在商品禽中十分常见，其中国内养殖厂存在鹅星状病毒的感染情况，发病主要集中在3周龄内雏鹅。1型和2型鹅星状病毒的混合感染会提高患病雏鹅的死亡率[10]。鹅星状病毒是可以通过胚胎垂直传播[11-13]。且星状病毒的基因组很容易发生同源重组，同种星状病毒可感染不同物种，为星状病毒的传播提供了广泛的载体，增加了星状病毒跨种传播的机率[14]。这些影响了鹅星状病毒免疫及治疗的研究。

目前鹅星状病毒常见的检测方法为分子生物学检测。已知的检测方法有RT-PCR[15-16]、实时荧光定量PCR[17-18]、环介导等温扩增技术[19]等。但分子生物学检测方法只能判断是否存在病毒感染，无法排除母源抗体的干扰，不能净化种鹅厂的种鹅。

血清学检测常用于检测血清中的星状病毒相关抗体的含量，证明鹅是否感染或者鉴定疫苗免疫后抗体情况。血清中和实验也是鉴定星状病毒不同亚型的标准。衣壳蛋白包含星状病毒最主要的抗原表位，能刺激机体产生特异性中和抗体，其中纤突蛋白参与了病毒粒子与细胞表面特异性膜受体的结合，是血清抗体识别的重要抗原位点之一。目前没有以纤突蛋白为包被抗原的鹅星状病毒血清抗体检测的产品，因此本研究以原核表达鹅星状病毒的ORF2纤突蛋白，以该蛋白为包被抗原，建立了特异性、重复性、敏感性良好的间接ELISA检测方法。该方法可有效监测鹅星状病毒的流行情况。同时，可以通过分子生物学检测及血清学检测方法的结合，有效减少母源抗体对疫苗免疫的干扰。因近年出现毛皮动物食用污染的禽副产品而感染星状病毒的情况，本方法可用于监测毛皮动物是否成为星状病毒跨地区或跨种传播的中间宿主。本研究建立间接ELISA检测方法有很好的应用价值。