腊梅花多酚类物质及挥发油的成分分析

杨浩，王文杰，雷霜江，吕青遥，杜凤瑶，焦士蓉

西华大学食品与生物工程学院（成都 610039）

腊梅[Chimonanthus praecox（L.）Link]为腊梅科腊梅属落叶丛生灌木[1]，多分枝，皮灰白色，生长于亚热带湿润的常绿落叶阔叶混交林地带，属于第四纪冰川孑遗植物。腊梅是我国的特产植物，在我国南部分布广泛，以长江流域最为丰富。腊梅的花、茎、根均可入药，具有解毒清热、理气开郁的功效，常用于治疗感冒、解热镇痛、止咳化痰、降压和改善免疫系统，功效显著[2]。植物化学研究表明腊梅花富含龙脑、桉精油和芳樟醇等精油成分[3-4]，黄英等[5]报道腊梅花精油中含有的β-榄香烯能抑制癌细胞生长，促进凋亡细胞死亡。此外，腊梅花中还含有非挥发性的生物碱、黄酮类、多酚类等物质，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎症、抗氧化、抗高血压及糖尿病等作用[6-10]。

此次试验为了进一步从腊梅花中寻找具有生物活性的天然产物，分别对腊梅花挥发油成分和非挥发性成分多酚类物质进行提取和研究。采用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）对超临界CO2萃取腊梅花挥发油成分进行分析，高效液相色谱法（HPLC）分析其腊梅花多酚成分，为进一步开发利用腊梅的药用和经济价值提供参考。

1 试验方法

1.1 多酚提取方法

参考包善思等的提取方法[11]，将腊梅花干花粉碎后过80目（粒度：198 μm）筛，于60 ℃恒温干燥12 h，采用乙醇以料液比1∶30 g/mL微波提取，微波功率406 W，微波时间50 s，将提取液离心（7000 r/min）10 min，收集上清液，浓缩冻干，将冻干样品于4 ℃保存。

1.1.1 多酚含量测定[12]

称取10 mg没食子酸标准品，于100 mL容量瓶中，加去离子水溶解，定容，配制质量浓度为0.1 mg/mL的母液备用。准确吸取母液0，2，4，6，8和10 mL分别置于10 mL的比色管中，用去离子水定容得0，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1 mg/mL的标准溶液。准确吸取0.5 mL标准溶液于10 mL比色管中，再加入0.5 mL 0.25 mol/L的福林酚试剂，在室温下反应5 min，最后加入2 mL 10% Na2CO3溶液，定容至刻度线，室温避光静置1.5 h，在765 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.1.2 样品多酚含量测定

取0.5 mL多酚冻干样品溶液，按照1.1.1方法测其吸光度，依次测定5次，取平均值。由按式（1）计算样品中总多酚含量。

式中：c为提取液中多酚质量浓度，mg/mL；v为样品溶液总体积，mL；n为稀释倍数；m为腊梅花粉总量，mg。

1.2 腊梅花挥发油提取

将刚摘的腊梅花自然风干，称取200 g干燥腊梅花粉碎过30目（粒度：495 μm）筛。将腊梅粉装入料筒放进萃取釜，按工艺要求开启萃取装置，调节萃取压力30 MPa、萃取温度40 ℃、萃取时间3.0 h、CO2流量25 kg/h，待制冷系统、萃取温度和CO2流量稳定后，开动高压泵进行循环萃取[13]。萃取3 h后，打开萃取阀，收集精油，在4 ℃下保存。精油得率按式（2）计算。

1.3 高效液相色谱法（HPLC）分析腊梅多酚提取物

1.3.1 样品处理

称取0.225 g冻干样品，加入22.5 mL甲醇，配制质量浓度为10 mg/mL的样品溶液，摇匀，离心，取上清液，稀释5倍，用0.22 μm滤膜滤过，得到质量浓度为2 mg/mL的样品进样分析。

1.3.2 标品配制

分别称取10 mg槲皮素、山柰酚、绿原酸、芦丁、阿魏酸、没食子酸对照品，用甲醇溶解定容至100 mL，得到质量浓度为0.1 mg/mL储备液，分别取10，20，30，40和50 mL储备液定容至100 mL，得到质量浓度为0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL的标准液，过0.22 μm滤膜备用，用于该6个化合物的定性鉴定。

1.3.3 色谱条件

参考夏玮等[14]的方法。Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，15% B；5～8 min，15%～100% B；8～17 min，100%～100% B；17～20 min，100%～15% B；20～23 min，15%～15% B）；体积流量1.0 mL/min；检测波长360 nm；进样量10 μL。

1.4 腊梅花挥发油GS-MS分析

1.4.1 顶空进样

将挥发油加入顶空进样瓶中，加入3%氯化钠，将进样瓶在60 ℃水浴中孵育40 min，期间插入进样针，富集样品。

1.4.2 气相色谱条件[13]

色谱柱：Rtx-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温条件：初始温度60 ℃，保持1.0 min，以3 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min；柱箱温度：60 ℃；进样口温度：250 ℃；进样模式：分流；压力：40.6 kPa；总流量：23.8 mL/min；柱流量：0.80 mL/min；线速度：32.6 cm/s；吹扫流量：3.0 mL/min；分流比：25.0；载气：氦气；进样量：1 μL；溶剂延迟：2.0 min。

质谱条件：电离方式：EI；电子能量：70 eV；离子源温度：200 ℃；接口温度：200 ℃；ACQ方式：

Scan；扫描速度：769 amu/s；扫描范围：40～400 amu。

2 结果分析

2.1 高效液相色谱成分分析结果

通过福林酚反应测定腊梅花多酚提取物纯度，多酚含量为124.06 mg/g，在360 nm波长下对腊梅花多酚提取物进行高效液相色谱分析，其HPLC图谱如图1所示。通过对同一标品不同浓度的峰面积进行计算得出浓度与峰面积之间的拟合函数，然后根据样品峰面积计算样品中对应物质的含量，成分鉴定见表1。

图1 腊梅花多酚提取物HPLC色谱图

表1 样品中各成分分析表

结果表明，腊梅花多酚提取物的主要成分为儿茶素、绿原酸、芦丁、阿魏酸、槲皮素和山奈酚，其中山奈酚含量最高（42.57 mg/g），阿魏酸其次（42.51 mg/g），然后是绿原酸（32.12 mg/g），儿茶素含量为20.75 mg/g，槲皮素含量较低，只有7.32 mg/g，芦丁含量最低，只有4.98 mg/g。根据文献资料[15-18]，山奈酚、阿魏酸、绿原酸和槲皮素具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗血小板凝固、降血脂、防止动脉粥样硬化和增强免疫力等功效，因此腊梅花的药理作用可能主要归因于这几种物质的共同作用。

2.2 腊梅花挥发油GC-MS分析

200 g新鲜腊梅花原料采用超临界CO2萃取得到2.63 g精油，精油得率为1.32%，将提取的精油加入1.5 g NaCl在60 ℃下加热孵育40 min，使其挥发性成分能更好的富集在顶空进样针上，然后进行GC-MS分析，色谱图如图2所示。对精油成分进行鉴定，见表2。

图2 腊梅花挥发油GC-MS图谱

表2 腊梅花挥发油成分鉴定表

接表2

通过GC-MS自带的NISTO5s.LIB和NISTO5.LIB谱图库自动检索获得目标组分的初步鉴定结果，再结合相关专业知识和有关文献资料进行人工谱图解析，最终确定精油化学组成成分，总共鉴定出42个香气成分，其中：醇类4个，占11.78%；醛类2个，占1.13%；酯类1个，占1.12%；萜烯类30个，占74.75%；其他成分5个，占11.22%。含量较高的成分为β-石竹烯（15.57%）、（+）-δ-杜松烯（10.01%）、（-）-α-依兰油烯（9.16%）、苄醇（8.16%）、α-蒎烯（7.35%）、（+/-）-顺式-金刚烷烯（7.01%）、榄香烯（5.7%）、双环菊酯（4.89%）、芳樟醇（2.58%）。β-石竹烯和它的酰化物具有特殊的香味，同时还有抗焦虑、抗抑郁等[19]作用，使其被用于开发化妆品、香水和除臭剂[20]等产品，β-石竹烯和其衍生物还有很多医药方面的活性，王志祥[21]在专利中报到β-石竹烯具有镇咳、祛痰等作用，可用于制作适当的复方制剂。此研究结果可为腊梅花挥发油开拓更广泛的应用市场奠定可靠的理论基础。

3 结论

主要对腊梅花的天然活性产物进行了提取研究，包括其挥发性成分和多酚类物质，并通过HPLC及GC-MS分析鉴定其成分，为腊梅花天然活性产物及代谢产物的研究和生物资源的开发利用提供了可靠的理论依据和技术方法。采用微波辅助法提取腊梅花多酚物质，多酚含量为124.06 mg/g，通过HPLC分析腊梅花多酚物质，结果发现其主要成分为绿原酸、芦丁、阿魏酸、槲皮素和山奈酚，其中山奈酚含量最高（42.57 mg/g），阿魏酸其次（42.51 mg/g），然后是绿原酸（32.12 mg/g），儿茶素含量为20.75 mg/g，槲皮素含量较低，只有7.32 mg/g，芦丁含量最低，只有4.98 mg/g。采用超临界CO2萃取腊梅花挥发油，精油得率为1.32%，并用GC-MS分析其成分总共鉴定出42个香气成分，其中萜烯类30个，含量最高，占74.75%。相对含量较高的成分为β-石竹烯（15.57%）、（+）-δ-杜松烯（10.01%）、（-）-α-依兰油烯（9.16%）、苄醇（8.16%）、α-蒎烯（7.35%）、（+/-）-顺式-金刚烷烯（7.01%）、榄香烯（5.7%）、双环菊酯（4.89%）、芳樟醇（2.58%）。研究表明腊梅花中的天然产物如山奈酚、槲皮素、阿魏酸等均具有良好的药理作用，β-石竹烯具有特殊香味，同时还有一定的抗焦虑和抗抑郁作用，因此腊梅花可作为药剂和化妆品香水的天然原料，或可衍生至养生保健食品等领域，是一种可利用价值极高的天然资源。