水产品中N-亚硝胺形成和控制的研究进展

杨姗姗，王兆琦，王晓雯，蒋万枫，张凤艳

青岛市食品药品检验研究院（青岛 266073）

N-亚硝胺（N-nitrosamine，NAs）是世界上公认的致癌物之一，具有致癌性、致畸性及致突变性，会对人体造成极大伤害，广泛存在于食品、酒精饮料及饮用水中。肉制品和水产品富含蛋白质，极易受到微生物污染，发生降解，生成胺类物质，与氮氧化合物结合生成NAs，所以加工肉制品、水产品等食品中存在较高含量的亚硝胺。

国内外学者对肉制品中NAs研究较多，对水产品中NAs研究相对较少。水产品富含大量营养物质，消费量逐年升高，应重视水产品中NAs含量。因此，对NAs进行概述，介绍水产品中NAs生成机理，并总结影响水产品中NAs生成的因素及控制技术，以期为降低我国水产品中NAs含量、提高水产品的质量和安全性提供参考。

1 亚硝胺概述

1.1 致癌性

NAs是世界公认的三大强烈致癌物之一，具有遗传毒性，可导致DNA损伤，引起碱基突变，诱发癌症。大量试验证明，摄入NAs会增加罹患胃癌、食管癌、鼻咽癌和膀胱癌的风险[1]。1987年，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）将NDMA和NDEA列为2A致癌物；将N-甲基乙基亚硝胺（N-Methylethylnitrosamine，NMEA）、N-亚硝基吡咯烷（N-Nitrosopyrolidine，NPYR）、N-亚硝基哌啶（N-Nitrosopiperidine，NPIP）等列为2B致癌物。长期少量摄入或一次摄入大量NAs均会诱发肿瘤。

NAs是间接致癌物，其致癌机理主要有：（1）氧化脱氨，使DNA碱基中的氨基氧化；（2）细胞色素CYP2E1酶系统催化NAs羟化和裂解，形成重氮离子，促使核酸烷基化；（3）细胞色素P450酶激活作用，形成烷基化的DNA碱基[2-3]；（4）塑造炎症微环境，激活氧化应激和炎症反应信号通路，造成DNA损伤，引起癌基因转录表达[4]。

1.2 毒性

一次或多次摄入含过量NAs的食物会引发NAs急性中毒，主要表现为肝脏损伤及血小板破坏，严重时可导致全身中毒。以NDMA动物急性毒性试验为例，大鼠半数致死量（LD50）为24～40 mg/kg。据有关资料推测，如果儿童一次摄入量达到300 mg，成人一次摄入量达到1 200 mg就会导致死亡。有报道人体对挥发性NAs耐受水平在5～10 μg/kg[5]。NAs会导致以肝硬化为主的慢性中毒，主要发生在经常食用含NAs食品（腌肉、咸鱼、腌菜等）的人群中[6]。

2 NAs的形成过程以及影响因素

2.1 NAs的形成机理

NAs是由胺类物质与亚硝基化合物发生亲电反应形成的。胺类物质主要是指伯胺、仲胺、叔胺、羟胺及胺过氧化物等；亚硝化试剂包括N2O3、N2O4及亚硝酸根离子（NO+·H2O）等[7]。

大部分学者认为食品中NAs生成途径：酸性条件下，亚硝酸盐与H+发生反应生成亚硝酸，亚硝酸不稳定分解产生N2O3，N2O3与胺类物质发生亚硝化反应，生成NAs，见图1。

图1 NAs反应生成图

仲胺与亚硝化试剂可形成稳定的NAs，伯胺与亚硝化试剂发生反应，生成重氮中间体，会立即分解为醇和氮[8]。叔胺也可通过脱烷基亚硝化反应生成NAs，但速率要比仲胺慢得多。在醛，特别是甲醛存在下，亚硝化反应被催化，甚至可以在中性或碱性条件下进行[9]。

2.2 影响因素

水产品中NAs含量受多种因素影响，主要包括pH、温度、前体物质浓度、添加剂、加工处理方式及微生物作用等。

2.2.1 pH

pH是影响NAs形成的重要因素。在酸性条件下，亚硝酸盐与H+结合形成亚硝酸，亚硝酸转化为氮氧化合物，才能与胺类物质反应形成亚硝胺。因此，若H+含量过低，亚硝酸盐就难以形成亚硝酸，从而降低NAs生成量。但如果H+含量过高，会导致胺类化合物质子化，不能与氮氧化合物发生反应；同时pH较低，影响硝酸盐还原菌的活性，不能有效催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，影响NAs的生成。一般认为，亚硝化反应最佳pH为3～4[10]。

2.2.2 温度

温度对NAs生成的影响很大。热处理是常用的水产品加工方式。温度每升高10 ℃，化学反应速率会增加1倍[1]。杨华等[11]采用体外模拟体系研究温度对NAs形成的影响，结果发现NDMA与NDEA的生成量随温度升高而增加。将脯氨酸与亚硝酸钠置于反应体系中，温度在4～80 ℃时，增大底物浓度，未生成NAs，在低底物浓度，温度121 ℃时，检测到NPYR。当底物存在时，高温是形成NPYR的必要条件。Drabik-markiewicz等[12]研究发现较高的加工温度会促进NDMA和NPYP的形成。升高温度不仅提高反应体系速率，也会加快蛋白质分解，增加胺类物质浓度，促进NAs生成。

2.2.3 组织成分

蛋白质发生腐败变质，会产生丰富的胺类物质，生物胺（微生物产生的脱羧酶促使氨基酸脱羧形成的一类小分子化合物）含量大幅增加，为NAs提供前体物质[13]。Drabik-markiewicz等[14]发现亚精胺对NDMA的形成有明显促进作用，亚精胺是NDMA的前体物质。

脂肪含量影响NAs的生成，新生成的NAs主要集中于脂肪。熊凤娇[15]研究脂肪对鱼糜制品NAs的影响，结果发现在鱼糜制品加工过程中添加脂肪可增加NMEA和NDEA含量，NAs含量与脂肪含量呈正相关，脂肪种类和比例会影响NAs含量。在加热过程中，脂肪温度较高，为NAs生成提供良好环境条件，另外脂肪在加热时氧化产生丙二醛及游离脂肪酸，释放自由基促进NAs生成[16]。

2.2.4 微生物

微生物对NAs生成起到促进作用，主要有3方面：一是肠杆菌属和厌氧芽胞杆菌属具有合成NAs的能力，青霉菌和根霉菌属对NAs合成起到生物催化作用[17]；二是微生物降解蛋白质为胺类，反硝化细菌可将硝酸盐转化为亚硝酸盐，为NAs生成提供前体物质；三是很多微生物在自身生长过程中，利用营养物质，生成H+，为NAs合成提供稳定酸性条件，如乳酸菌。

2.2.5 加工辅料

在水产品加工过程中，影响NAs形成常用添加剂主要包括硝酸盐和亚硝酸盐、NaCl、多聚磷酸钠、VC、VE及天然抗氧化物。硝酸盐和亚硝酸盐在水产品加工中的作用主要有形成独特风味、保持水产品鲜亮的颜色、抗氧化、抑制微生物生长、螯合和稳定制品。但NAs含量与亚硝酸盐含量呈正比。

在水产品加工中，添加NaCl可有效抑制微生物生长繁殖，延长水产品货架期。NaCl对亚硝胺的形成起抑制作用。Rywotycki[18]研究发现，添加2% NaCl要比未添加NaCl的肉中NAs含量低。NaCl与VC起到协同作用，添加2% NaCl和0.03% VC要比分别单独添加降低NDMA和NDEA的效果好。NaCl通过改变离子环境降低NAs含量。多聚磷酸盐可增加肉的持水能力，稳定乳状液，脂相和水相乳化时，促进亚硝基化合物和胺类物质交换，促使NAs生成[1]。

研究发现VC、VE、山梨酸、单宁酸、没食子丙酸、植物多酚等能够有效地抑制NAs形成[19]。VC是水溶性还原剂，VE是脂溶性还原剂，可将HNO2还原成NO，有效减少NAs前体物质，阻断NAs的生成[17]。

在水产品加工过程中添加一些香料物质，如黑胡椒、辣椒粉等。黑胡椒中含有哌啶和N-硝基哌啶，添加黑胡椒会导致NPIP的生成[20]。

2.2.6 加工处理方式

Yurchenko等[21]对肉制品进行不同加工处理，结果发现油炸肉中NAs含量最高，其次是烤肉、熏肉，再次是半熏香肠和火腿，而生肉中未发现有NAs。Li等[22]也发现油炸处理会导致NAs含量增加。加工处理方式对NAs产生影响原因在于：不同加工处理方式达到的温度不同，油炸温度显著高于蒸煮、微波加热温度；熏制方式会产生更多的氮氧化合物，为亚硝化反应提供亚硝化试剂；腌制鱼要比干制鱼中NAs含量高，腌制时间、温度及腌制过程中的微生物会影响NAs的生成[23]。

3 控制NAs形成的方法

NAs是影响水产品安全的风险因子，形成后难以降解[24]，需有效控制。可从控制NAs前体物质含量、阻断NAs合成、增加NAs降解3个方面入手。

3.1 减少NAs前体物质含量

NAs是由亚硝酸盐与胺类物质通过多级反应生成的。可通过控制亚硝酸盐使用量及减少胺类物质产生2个方面入手。

3.1.1 控制亚硝酸盐含量

亚硝酸盐是剧毒物质，中毒量为0.2～0.5 g，致死量为3 g。摄入较多亚硝酸盐会引起机体缺氧，严重时会导致死亡；亚硝酸盐是致癌性NAs的前体物质，所以国内外很多学者都在研究亚硝酸盐替代物及降解亚硝酸盐的方法。主要方法有：（1）化学物质替代亚硝酸盐。芹菜汁、番茄红素、干红葡萄渣、天然香料提取物、亚硝基化血红蛋白、山梨酸钾和红曲色素等用于替代亚硝酸盐的功能或部分功能[25-29]。王卫等[25]采用商业化天然植物提取物T10（脱水醋粉、麦芽糊精的等量混合物）和DV（白柠檬、甜橙、迷迭香、葡萄柚、石榴提取物的等量混合物）代替亚硝酸盐，用于风干鱼腌制，结果表明添加T10和DV鱼中亚硝酸盐残留量远低于添加亚硝酸盐组，添加T10呈现出的色泽与添加亚硝酸盐组无差异，2种植物提取物抑菌效果弱于亚硝酸盐。（2）微生物发酵替代亚硝酸盐或降解亚硝酸盐。一些乳酸菌、葡萄球菌以及片球菌可将高铁肌红蛋白转化为肌红蛋白衍生物，起发色作用[30]。刘玉等[31]从腌制蓝圆鲹干中分离出罗伊乳杆菌，将其应用于降解金线鱼鱼糜亚硝酸盐，降解率达65.33%。（3）采用超声波、超高压等物理方法降解亚硝酸盐。张丽华等[32]优化超声波处理咸海鲶鱼条件，超声波功率200 W、时间24 min，咸鱼质量12 g，对亚硝酸盐的消除率为99.4%。艾颖超等[33]采用高压处理真空包装的鲈鱼，亚硝酸盐含量有所增加，随着贮藏时间延长，残留的亚硝酸盐含量呈现下降趋势。物理方法对降解亚硝酸盐作用有限，还会破坏样品组织结构完整性。

然而大部分亚硝酸盐替代物只能代替亚硝酸盐部分功能，不能完全替代其所有功能，且因替代物稳定性、分散性、成本等多方面原因，各种替代物在实际生产中应用很少。

3.1.2 减少胺类物质的产生

水产品富含蛋白质和胺类物质，腐败变质更易产生胺类物质，所以可控制微生物以抑制NAs生成。水产品可通过低温贮藏、气调包装、辐照降解、高压处理、使用食品添加剂等抑制或减少生物胺的产生，还可通过接种微生物（木糖葡萄球菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌等）降解生物胺[34]，但还需大量研究才能应用于实际生产。

3.2 阻断NAs的合成

通过阻止亚硝酸盐和胺类物质发生反应以阻断NAs的合成是控制NAs含量的重要方法，主要机理是通过添加一些还原性物质避免或减少亚硝基化合物发生氧化。国内外学者对此进行大量研究，多种果蔬和香辛料的提取物均可以阻断NAs的合成，主要原因是这些提取物中富含VC、VE、黄酮、多酚、还原糖等具有还原性的化合物。

VC不仅能够促使亚硝酸盐还原，阻止胺类与亚硝基结合，还可防止NO被氧化为NO2[35]。VE可捕获自由基的活性氢，阻止链式反应，阻断亚硝胺的合成[36]。Pourazrang等[37]发现VC和VE对亚硝胺的抑制起协同作用。

林栋等[38]从贵长猕猴桃提取多酚物质，并模拟人体胃酸条件，结果发现猕猴桃提取物可有效清除亚硝酸盐，清除率达到87.15%，进而阻断亚硝胺的合成，阻断率为81.63%。Choi等[39]模拟人体消化系统，评估草莓、甘蓝及大蒜对NDMA形成的影响，结果发现草莓中的抗坏血酸、甘蓝中的酚类物质和大蒜中的烯丙基硫类化合物可以降低亚硝酸盐的残留量，抑制NDMA的形成。

3.3 NAs的降解

3.3.1 物理方式降解

辐照技术通过抑制微生物生长达到食品保鲜的目的。Ahn等[40]发现辐照技术可有效降解发挥性NAs，且在体外条件下未发现NAs分解物重组。Ahn等[41]采用γ辐照技术处理发酵凤尾鱼酱，结果发现采用5 kGy以上剂量时，可以显著降低NDMA和NPYR含量，辐照强度越强，抑制率越高，贮藏4周，辐照样品中NAs含量显著低于对照组。虽然辐照处理可有效降低NAs含量，但高剂量辐照处理会降低水产品感官品质，引起蛋白质变性、油脂氧化等问题[42]，且目前还不清楚辐照降解NAs机理，因此采用辐照技术降解NAs还需进一步研究。

3.3.2 生物方式降解

利用微生物降解亚硝胺是一种可行的生物方式。目前多数研究集中于筛选降解亚硝酸盐菌种，已知具有降解亚硝胺功能的菌种比较少。

游刚等[43]从腌制咸鱼中分离出植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌、嗜酸乳杆菌和短乳杆菌，优化比例复配，将复合菌添加至腌制咸鱼中，结果发现复合菌可有效降解NAs。Nowak等[44]研究4株益生菌（鼠李糖乳杆菌0900、鼠李糖乳杆菌0908、干酪乳杆菌0919和短杆菌0945）对NDMA影响，结果发现益生菌对NDMA降低率达50%，其中短杆菌0945效果最显著。许女等[45]从19株植物乳酸菌中筛选出L.plantarumCP3，此菌对亚硝酸盐和生物胺的降解率达到95%和77%，显著抑制NAs生成，与L.sakiM4联合接种，发酵48 h，对NDMA的降解率达75.8%。

已筛选出一些分别具有降解亚硝酸盐、生物胺和NAs能力的菌种，但既可降解NAs，又能降解亚硝酸盐和生物胺的菌种还比较少，所以还需要加大筛选力度，找到同时降解3种物质的菌种，研究发挥作用的具体酶类，制成固定化酶，应用于生产中，可有效减少NAs含量，提高食品的安全性。

除此之外，还可以通过采用新鲜的原材料、改变加工方式等方法减少NAs生成。

4 结语

近年来，水产品消费量逐年攀升，其安全性受到广泛关注。NAs是毒性很大的致癌物，在水产品贮藏、加工处理过程中很容易产生，严重危害消费者身体健康。

国内外研究者对NAs进行大量研究，主要集中于肉制品加工处理过程，针对水产品中NAs形成机理、影响因素及控制方法的研究还比较少，不能系统揭示水产品中NAs的形成变化降解规律，需要加大研究力度。

本文对NAs形成机理进行阐述，并就影响水产品中NAs形成的因素进行总结，证明水产品中难以避免存在大量NAs，因此，建议加大对水产品中NAs控制的研究。减少NAs前体物质方面，寻找可完全替代亚硝酸盐物质是研究热点，利用蔬菜所含的硝酸盐转变为亚硝酸盐，是新颖、安全性较高的研究方向；采用新鲜水产品进行加工处理以减少胺类物质的产生。阻断NAs形成方面，筛选可阻断NAs生成且适合水产品使用的高效物质。降解NAs方面，需进一步研究辐照处理降解NAs的机理；采用微生物发酵技术降解NAs是今后研究重点方向，筛选同时具备降解NAs、亚硝酸盐和生物胺能力的菌种，并确定发挥作用的酶，采用固定化技术应用于实际生产中。此外，还可以综合使用物理、化学及生物防控技术以减少水产品NAs含量，提高水产品安全性。