车前草总黄酮的大孔树脂富集及抗氧化活性研究

戴富才，张欣，张晶晶，张晓轩，卢玉伟，肖立伟

廊坊师范学院化学与材料科学学院（廊坊 065000）

车前草别名车前、车轮菜、猪耳草、钱串草等，具有镇咳、祛痰、平喘、利尿通淋、清肝明目、清热解毒等功效[1]，还可以促进呼吸道黏膜分泌黏液，稀释痰液、清肺化痰。车前草中的有效成分有多糖、黄酮、生物碱等[2]，其中，黄酮类化合物是一类呈黄色或橙黄色的化合物[3]，具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化自由基等功能，有很好的药用价值[4]。

分离纯化黄酮类化合物方法众多[5]，由于大孔树脂有选择性好、成本低、易再生处理等优点，大孔树脂吸附法被广泛用于中草药活性成分的研究[6-8]，徐怀德等[9]研究大孔吸附树脂纯化洋葱皮总黄酮，发现X-5型树脂分离纯化效果较好，洪雪娥等[10]研究大孔树脂对薯蔓黄酮吸附分离特性，表明AB-8型大孔吸附树脂比较适用于薯蔓黄酮的纯化。但对车前草总黄酮的大孔树脂纯化工艺研究却少有报道。

试验以车前草为原料，采用正交试验法，优选大孔树脂提纯车前草中总黄酮的最佳工艺，并以抗坏血酸和芦丁标准品为对照，对车前草总黄酮的抗氧化活性进行研究，可为车前草的开发利用提供一定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

车前草产自湖北省武汉市蔡甸区；芦丁标准品（纯度＞98%，武汉天植生物技术有限公司）；大孔树脂NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD400、AB-8、D101、X-5等（分析纯，天津市精细化工研究所）；2,2-联氮-双（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）（分析纯，上海泰坦科技有限公司）；无水乙醇、三氯乙酸等试剂（均为国产分析纯）。

1.2 仪器与设备

722N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；XFB-400高速中药粉碎机（湖南吉首市中湘制药机械厂）；KQ-250B超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；RE-5203A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FA1640A电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；THZ-82A水浴恒温振荡器（金坛市荣华仪器制造有限公司）；TDL-80-2B低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；酒精计（河北省武强红星玻璃仪表厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁对照品的配制和标准曲线的绘制

准确称取20.0 mg芦丁对照品于50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶解，得0.4 mg/mL对照品溶液。分别精密吸取0，0.2，0.5，1.0，2.0和3.0 mL的上述溶液于25 mL容量瓶，各加30%乙醇水溶液至10 mL，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀静置10 min，加10%氯化铝溶液0.3 mL，摇匀静置10 min，5%氢氧化钠溶液4 mL，加水至刻度，摇匀静置15 min，配成质量浓度分别为0，0.003 2，0.008，0.016，0.032和0.048 mg/mL的系列对照品溶液，在507 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，并计算其线性回归方程[11]。

1.3.2 车前草总黄酮得率、含量和产率的计算

车前草总黄酮吸附率、解吸率、得率、含量和产率计算[9]如式（1）～（5）所示。

式中：E为车前草总黄酮吸附率，%；D为车前草总黄酮解吸率，%；η为车前草总黄酮得率，%；W为车前草总黄酮含量，mg/g；Y为车前草总黄酮产率，%；C0为车前草总黄酮起始质量浓度，mg/mL；Ce为车前草总黄酮平衡质量浓度，mg/mL；Cd为车前草总黄酮解吸液质量浓度，mg/mL；Vd为车前草样品解吸后体积；V0为车前草样品吸附平衡时的体积；C为溶液中车前草总黄酮的质量浓度，mg/mL；V为所取车前草样品溶液体积，mL；M为所取车前草样品溶液烘干后干物质质量，g；G1为纯化后样品烘干后质量，g；G2为车前草质量，g。

1.3.3 树脂预处理

按文献[12]将大孔树脂进行活化，备用。

1.3.4 车前草总黄酮粗提液的制备

将车前草用XFB-400高速中药粉碎机搅碎，用0.25 mm即60目筛过筛，得车前草粉末。

称取车前草粉末6.0 g，按料液比1∶20（g/mL），用70%乙醇溶解，放在60 ℃、210 W的超声清洗器中工作80 min，抽滤，弃去沉淀，用旋转蒸发仪旋蒸，除去大部分乙醇（酒精计测得乙醇体积分数约2%），用去离子水定容于250 mL容量瓶中，得车前草总黄酮粗提液[13]，备用。

1.3.5 大孔树脂提纯车前草中总黄酮的单因素试验

以车前草总黄酮粗提液为原料，以树脂提纯后样品中总黄酮的得率为指标，研究树脂种类、吸附液pH、吸附液质量浓度和解吸液乙醇体积分数这4个因素对大孔树脂纯化总黄酮的影响。

1.3.5.1 树脂种类对大孔树脂提纯车前草中总黄酮的影响

取1.0 g处理好的AB-8、X-5、NKA-9、NKA-II、D101、HPD400等6种树脂，放于150 mL的锥形瓶中并加15 mL 0.1 mg/mL的粗提液，置于25 ℃、120 r/min的水浴恒温振荡器中震荡6 h至吸附完全[14]，过滤，取1 mL滤液放入25 mL容量瓶中，按步骤1.3.1显色法测定吸光度，计算吸附液中总黄酮质量浓度。用去离子水洗净并抽干树脂置于锥形瓶中，加入25 mL 80%乙醇，震荡6 h至解吸完全，取出过滤，测定解吸液中总黄酮的质量浓度，计算总黄酮得率。

1.3.5.2 吸附液pH对大孔树脂提纯车前草总黄酮的影响

调节粗提液至pH 3，4，5，6和7（盐酸溶液和NaOH溶液调节），其他条件不变，参照1.3.5.1进行吸附解吸试验，研究吸附液pH对大孔树脂提纯车前草总黄酮的影响。

1.3.5.3 吸附液质量浓度对大孔树脂提纯车前草中总黄酮的影响

将粗提液质量浓度调为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL，其他条件不变，参照1.3.5.1进行吸附解吸试验，研究吸附液质量浓度对大孔树脂提纯车前草总黄酮的影响。

1.3.5.4 解吸液乙醇体积分数对大孔树脂提纯车前草中总黄酮的影响

将解吸液的乙醇体积分数调整为50%，60%，70%，80%和90%，其他条件保持不变。吸附和解吸试验参照1.3.5.1，研究解吸液的乙醇体积分数对大孔树脂提纯车前草总黄酮的影响。

1.3.6 正交试验

在4个单因素试验基础上，以总黄酮含量为指标，设计L9(34)正交试验，优化工艺。

1.3.7 动态分离纯化车前草中的总黄酮

1.3.7.1 上样液体积和流速的测定

把处理好的树脂分别装在3支1.2 cm×40 cm的玻璃层析柱中，高度15 cm左右，按照正交试验的最优条件上样，分别控制流速1，2和3 BV/h，收集每1 BV并根据步骤1.3.1测定吸光度。洗脱液的吸光度达到上样溶液吸光度的1/10时，即为泄漏点。认为黄酮类物质已通过，停止上样[9]。选择最佳的上样液体积和吸附流速。

1.3.7.2 解吸液体积的测定

将吸附总黄酮达到泄漏点的树脂，按照正交试验得出的最优解吸条件进行解吸。每1 BV收集1次，分别取样检测，测定解吸液中总黄酮含量，确定最优解吸液体积。

1.3.7.3 最佳工艺条件的验证

在最佳工艺条件下，以总黄酮含量为检验指标进行3次平行验证试验[14]。

1.3.8 车前草总黄酮含量的计算

在最佳工艺条件下将粗提液经树脂纯化，收集解吸液，取1 mL的解吸液于25 mL容量瓶中，按照1.3.1步骤中的显色方法测其吸光度，计算总黄酮的质量浓度C。将剩余的解吸液经旋转蒸发浓缩后进行真空干燥，称重，得M。由式（4）计算车前草总黄酮含量。

1.3.9 车前草总黄酮产品产率的计算

称取6.045 4 g车前草粉末制成粗提液，在最佳工艺条件下进行纯化，蒸发浓缩，真空干燥，得到干物质的质量为0.190 9 g。由式（5）计算车前草总黄酮产率。

1.3.10 ABTS+·清除率的测定

ABTS+·溶液：称取1.892 2 g K2S2O8定容至50.0 mL，取440 μL，用电子天平称取0.096 0 g ABTS定容至25 mL，二者混合，避光反应20 h，使ABTS+·溶液吸光度达到0.700±0.002（用乙醇稀释）[15]。取乙醇1.0 mL加ABTS+·溶液9.0 mL，过10 min，以乙醇为空白，在734 nm处测量溶液吸光度，记为A0，取各浓度试样溶液1.0 mL，加ABTS+·溶液9.0 mL，反应10 min，以各浓度试样溶液1.0 mL，加乙醇9.0 mL为空白，在734 nm处测量溶液吸光度，记为A。每个浓度平行测定3次，取平均值。根据式（6）计算样品对ABTS+·清除率，并以抗坏血酸、芦丁做对比试验，比较各试样对ABTS+·清除率的大小。

式中：SA为试样对ABTS+·清除率，%；A0为样品浓度为0时的A734nm值；A不同浓度样品的A734nm值。

1.3.11 铁氰化钾还原能力的测定

取1.0 mL不同质量浓度的总黄酮溶液，分别加①号溶液1.0 mL，②号溶液1.0 mL，50 ℃水浴中反应20 min，加③号溶液1.0 mL，取2.5 mL，在小试管中加2.5 mL去离子水，加④号溶液1.0 mL混匀后静置15 min。空白：其他条件不变，①号溶液用1.0 mL去离子水替代，在700 nm处测吸光度，按照式（7）计算样品对铁氰化钾的还原能力[16]，并以抗坏血酸、芦丁做对照试验，比较试样对铁氰化钾还原能力的大小。

式中：Sf为样品对铁氰化钾的还原能力；Af为待测样品吸光度；Af0为空白组吸光度；①～④号溶液分别为：①0.5000 g K3Fe(CN)6，定容至50 mL；②NaH2PO42.4930 g，Na2HPO41.4397 g混合定容至100 mL；③5.000 g CCl3COOH，定容至50 mL；④0.1000 g FeCl3（为防止水解，滴入少量盐酸），定容至100 mL。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

标准曲线的回归方程为y=0.0057+12.68452x，R2=0.9989。在0～0.048 mg/mL之间，芦丁的质量浓度与样品吸光度呈线性关系。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验结果与讨论

2.2.1 树脂的筛选

由表1可知，不同极性的树脂对黄酮的吸附和解吸结果不同，AB-8、D101、X-5这3种树脂有较高的吸附率，HPD-400、AB-8、X-5树脂具有较高的解吸率。综合得率、吸附率、解吸率，得出AB-8树脂对静态吸附黄酮的效果最好，所以最优树脂为AB-8；AB-8、X-5、D101型树脂为正交试验的3个水平。

表1 不同树脂对车前草总黄酮的吸附和解吸结果

2.2.2 吸附液pH对车前草中总黄酮分离与纯化的影响

由图2可知，吸附液pH 6时，得率最高，达到85.25%。由于黄酮类化合物是具有一定酸性的多羟基酚类化合物，当pH＜6或pH＞6时，黄酮类化合物的稳定性会降低。所以最优pH为6，选择pH 5，6和7作为正交试验的3个水平。

图2 吸附液pH对吸附效果的影响

2.2.3 吸附液质量浓度对车前草中总黄酮的分离与纯化的影响

从图3知，随着吸附液质量浓度增加，总黄酮得率也随之增加，吸附液质量浓度0.8 mg/mL时，总黄酮得率为93.01%，为最高。吸附液质量浓度大于0.8 mg/mL时，样品液中的杂质也会随之增加，杂质与黄酮产生竞争吸附反而抑制黄酮分子在树脂中的扩散[17]。所以选择0.8 mg/mL为最佳吸附液质量浓度，正交试验的3个水平选择0.6，0.8和1.0 mg/mL。

图3 吸附液质量浓度对吸附效果的影响

2.2.4 解吸液乙醇体积分数对车前草中总黄酮的分离与纯化的影响

从图4知，车前草总黄酮得率随着解吸液乙醇体积分数增加而增加。解吸液乙醇体积分数80%时，车前草总黄酮得率最高，为91.92%。但是，如果乙醇体积分数过高，大部分杂质也会一起洗脱，从而降低总黄酮纯度[7]。因此，解吸液的最佳乙醇体积分数为80%，正交试验的3个水平选择乙醇体积分数70%，80%和90%。

图4 洗脱剂的体积分数对车前草总黄酮纯化的影响

2.3 优化树脂静态分离纯化车前草中总黄酮的正交试验

在单因素试验基础上，设计四因素三水平正交试验，如表2所示。研究这4个因素对总黄酮含量的影响，进一步优化大孔树脂的纯化工艺。L9(34)正交试验结果见表3。

表2 正交试验因素水平表

表3 L9(34)正交试验结果

经极差分析得出RB＞RA＞RC＞RD，各因素对黄酮类化合物含量的影响顺序为：吸附液pH＞树脂种类＞吸附液质量浓度＞解吸液乙醇体积分数。其中，对黄酮含量的影响最大的是吸附液的pH。在试验设计的范围内，纯化总黄酮的最佳工艺条件为A1B2C3D3，即AB-8树脂、吸附液pH 6、吸附液质量浓度1.0 mg/mL、解吸液乙醇体积分数90%。

3次平行验证试验得出黄酮含量的平均值为732 mg/g。

2.4 动态试验分离纯化车前草中的总黄酮

2.4.1 泄漏点的测定及流速对纯化工艺的影响

由图5可以看出，上样液流速1 BV/h效果最好，泄漏点出现的最晚。但过低的流速会使试验的循环周期变长，又因为1和2 BV/h泄漏点出现时吸附液的体积相差较少，所以综合考虑，选择上样液流速2 BV/h。此时上样液体积为14 BV。

图5 上样液流速对AB-8树脂吸附黄酮的影响

为便于操作，解吸液和吸附液选择相同流速，即2 BV/h。

2.4.2 解吸液体积对纯化工艺的影响

由图6可知，解吸液体积达到4 BV时可以基本解吸完全，再添加解吸液时，也会有少量总黄酮流出，但浓度很低。从成本方面考虑，选取4 BV洗脱液进行洗脱。

图6 解吸液体积对纯化工艺的影响

2.5 最佳工艺条件的验证

根据上述试验结果，选择最佳纯化工艺参数，进行3次平行验证试验，黄酮含量的平均值为875 mg/g。

2.6 车前草总黄酮含量

表4 纯化过程中总黄酮含量的变化

2.7 车前草总黄酮产率

表5 车前草总黄酮产率

2.8 总黄酮对ABTS+·的清除能力

由图7可知，抗坏血酸、车前草总黄酮、芦丁对ABTS+·都有一定清除能力，在0.2～2.1 mg/mL范围内自由基清除能力的大小为抗坏血酸＞车前草总黄酮＞芦丁。质量浓度达到1.6 mg/mL时，抗坏血酸对ABTS+·清除率为43.18%，车前草总黄酮为41.67%，芦丁为26.32%，可见车前草总黄酮的清除能力与抗坏血酸接近。

图7 ABTS+·清除能力的测定

2.9 总黄酮对Fe3+的还原能力测定

由图8可知，抗坏血酸、车前草总黄酮、芦丁对Fe3+都有一定还原能力，在0.2～2.1 mg/mL范围内它们的大小为抗坏血酸＞车前草总黄酮＞芦丁。在同样条件下，最大质量浓度2.1 mg/mL时，抗坏血酸对Fe3+的还原能力值达4.77，总黄酮达4.71，芦丁达4.59。质量浓度达到1.6 mg/mL时，继续增大浓度，Fe3+还原能力变化不大。

图8 Fe3+还原能力的测定

3 结论

用正交试验法优化并得到一条大孔树脂提纯车前草总黄酮的提纯工艺，在此工艺下，车前草总黄酮产率为3.16%，车前草总黄酮含量由249 mg/g提高到875 mg/g。抗氧化活性数据显示，纯化后的车前草总黄酮在0.2～2.1 mg/mL范围内，对ABTS+·、Fe3+均有不同程度的清除作用，清除率强弱顺序为抗坏血酸＞车前草总黄酮＞芦丁。表明车前草总黄酮具有一定抗氧化活性，可为车前草的深入开发、产业附加值的提高提供参考数据。