经方中半夏的炮制方法与现代半夏炮制方法的水溶性小分子成分的比较分析※

邓 亮,赵晓琴,张艳霞,王自润,柴茂山

(1.山西大同大学,山西 大同 037009;2.山西省大同市食品药品检验检测中心,山西 大同 037009)

经方中半夏的炮制方法为“汤洗”,其具体操作为“用热水反复将生半夏(鲜半夏)表面的毒性涎滑物质清洗干净”[1]。为了进一步验证此炮制方法的合理性,本课题拟通过在实验室对用经方中半夏炮制方法制出的“古法制半夏”与现代«中华人民共和国药典»(简称«中国药典»)炮制方法制出的等量法半夏、姜半夏、清半夏进行有效成分测量,并比较分析,以衡量经方中半夏炮制方法是否合理。

2015版«中国药典»中半夏的含量控制指标是酸碱滴定法检测总有机酸中琥珀酸的含量,而总有机酸以琥珀酸为主,琥珀酸是半夏的非专属性成分,规定不低于0.25%,但半夏硫熏后总有机酸含量会升高,所以2020版«中国药典»中删除了半夏总有机酸中琥珀酸的含量测定[2]。目前,现行«中国药典»中无半夏的质量控制指标,缺少专属性的质量控制方法。半夏作为一种常用的中药,其化学成分丰富,药理作用广泛,对半夏的有效成分进行进一步研究,可为探讨半夏的药理作用和安全用药奠定基础。有文献报道,半夏主要含有机酸、生物碱、核苷类、蛋白质、多糖等,目前报道的与药效相关的成分主要有生物碱、有机酸和核苷类,并采用高效液相色谱法(HPLC)测定不同产地半夏药材中尿苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸和盐酸麻黄碱5个代表性有效成分的含量[3]。本项目前期研究发现,不同产地、不同加工方式中有效成分的含量差异较大,不能有效控制半夏的质量。因此,本实验将采用分离效能和灵敏度较高的HPLC测定古法制半夏、法半夏、姜半夏、清半夏中鸟苷成分的含量,并对分析方法进行验证,且应用于各半夏炮制品的质量评价中,同时对古法制半夏、法半夏、姜半夏、清半夏中的鸟苷、腺苷、尿苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、琥珀酸等有效成分进行定性分析,建立其特征图谱质量表征方法,为半夏炮制品的质量表征与控制提供方法支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦LC 1260Ⅱ高效液相色谱仪,Shim-Pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,MS105DU电子分析天平(瑞士梅特勒),Practum224-1CN电子分析天平(德国赛多利斯),鼎泰双频超声仪,TG16-WS高速离心机(湖南湘仪)。

1.2 试剂 甲醇为色谱纯,对照品购自中国食品药品检定研究院,鸟苷对照品批号为111977-201501,含量为93.6%;腺苷对照品批号为110879-200202;尿苷对照品批号为110887-200202;盐酸麻黄碱对照品批号为171241-201007,含量为99.7%;盐酸伪麻黄碱对照品批号为171237-201003;琥珀酸对照品批号为110896-201602,供鉴别用。

1.3 药材饮片样品 研究用样品包括古法制半夏、法半夏、姜半夏、清半夏各两批;生半夏药材产地为山西夏县,古法制半夏采用«伤寒杂病论»中半夏的炮制方法“汤洗”炮制而成;法半夏、姜半夏、清半夏均从市场购买。各样品均经大同市食品药品检验检测中心鉴定,来源为天南星科植物半夏的干燥块茎。具体炮制方法如下,古法制半夏:取生半夏,趁鲜去皮,用热水淘洗数次,至半夏表面的涎滑物质清洗干净,烘干即得。法半夏、姜半夏、清半夏均按照2020版«中国药典»中方法炮制[2]。

2 方法

2.1 色谱条件及系统适用性实验 色谱柱:岛津shim-pack VP-ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以甲醇为流动相A,以水为流动相B,进行梯度洗脱(0～3 min,3%A;3～20 min,3%～10%A;20～40 min,10%～70%A;40～50 min,70%A);流速为每分钟0.8 m L;检测波长为254 nm;进样量为10μL;柱温为30℃。理论塔板数不应低于5 000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取鸟苷对照品11.05 mg、腺苷对照品10.25 mg、尿苷对照品10.76 mg,分别置于25 m L容量瓶中,加5%甲醇至25 m L,摇匀,再精密量取1 m L放入20 m L容量瓶中,加5%甲醇至20 m L,摇匀,制成含20.69μg/m L鸟苷溶液,作为对照品溶液。

精密称取盐酸麻黄碱对照品10.34 mg、盐酸伪麻黄碱对照品10.66 mg,琥珀酸对照品10.66 mg,分别置100 m L容量瓶中,加5%甲醇至100 m L,摇匀,制成含103.4μg/m L盐酸麻黄碱溶液,作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本实验样品粉末(过4号筛)约1.0 g,精密称定,置于100 m L具塞锥形瓶中,精密加水20 m L,密塞,称定重量,煎煮30 min,放冷,过滤,用水补足减失的重量,摇匀,离心(5 000 r/min)10 min,倾取上清液,过滤,续取滤液,过微孔滤膜(0.45μm),即得。

2.4 方法学考察(以鸟苷含量进行验证)

(1)线性范围考察 精密量取“2.2”项下的鸟苷对照品溶液(20.69μg/m L),用5%甲醇逐级稀释,得到不同质量浓度的鸟苷对照品溶液,在上述色谱条件下进样分析,回归方程为Y＝3 816.7X－0.323 2,R＝0.999 9,结果表明鸟苷在0.041 38～0.413 80μg范围内线性关系良好。

(2)精密度实验 吸取鸟苷对照品溶液(20.69μg/m L),连续进样6次,进样量为10μL,在上述色谱条件下测定鸟苷峰面积,计算相对标准偏差(RSD)为0.28%,结果表明精密度实验符合有关规定。

(3)稳定性实验 在室温条件下,取同一供试品(古法制半夏),按“2.3”供试品溶液的制备项下样品测定方法制备的溶液,分别在放置0、2、4、8、16、24 h后进样,进样量为10μL,测定鸟苷峰面积,计算RSD为0.98%,结果表明鸟苷在24 h内稳定性良好。

(4)重复性实验 取同一供试品(古法制半夏)样品,取样6份,按“2.3”供试品溶液的制备项下样品测定方法制备测定,进样量为10μL,做平行实验,每份进样2次,记录鸟苷峰面积,采用外标法计算,鸟苷含量平均值为0.102 5 mg/g,RSD为0.90%,结果表明重复性实验符合有关规定。

(5)加样回收率实验(采用加样回收法) 精密称取重复性考察测定后已知含量的供试品(古法制半夏)样品,按“2.3”供试品溶液的制备项下样品测定方法减半取量,每份约0.75 g,共称取6份,分别置于100 m L具塞锥形瓶中,再分别精密加入鸟苷对照品溶液(20.69μg/m L)5 m L,按“2.3”项下方法制备,并按以上色谱条件测定,记录鸟苷峰面积,采用外标法计算回收率,结果鸟苷平均回收率为102.0%,RSD为1.13%,结果表明加样回收率实验符合有关规定,见表1。

表1 鸟苷回收率实验测定结果

2.5 两个批次半夏炮制品样品鸟苷含量测定 对半夏两个批次的4种不同炮制方法炮制的半夏炮制品样品,按“2.3”供试品溶液的制备项下制备样品,按“2.1”色谱条件进样,经HPLC测定各样品中鸟苷含量,结果见表2。

表2 两个批次样品鸟苷含量测定结果

2.6 特征峰测定 取各样品,按“2.3”供试品溶液的制备项下制备样品,按“2.1”色谱条件进样测定。

2.7 特征峰指认 标记了10个含量较高且色谱分离效果稳定的色谱峰(琥珀酸成分的特征不包含在此特征图谱中),特征峰采用鸟苷对照品标记其特征峰,鸟苷对照品溶液色谱图见图1,腺苷对照品溶液色谱图见图2,尿苷对照品溶液色谱图见图3,盐酸麻黄碱对照品溶液色谱图见图4,盐酸伪麻黄碱对照品溶液色谱图见图5,琥珀酸对照品溶液色谱图见图6。(扫描题目右侧二维码查看图片。)

2.8 半夏炮制品特征图谱结果 各样品特征图谱见图7—10。(扫描题目右侧二维码查看图片。)记录各峰保留时间,确认保留时间范围,通过各峰面积值比较,以鸟苷色谱峰(峰5)为参比峰(s)比较各色谱峰相对峰面积情况,见表3。

表3 各样品特征图谱峰面积测定结果

3 结果

3.1 鸟苷含量测定 古法制半夏平均含量为0.112 5 mg/g,法半夏为0.091 2 mg/g,姜半夏为0.190 5 mg/g,清半夏为0.015 1 mg/g,见表2。

3.2 特征图谱表征

(1)从图谱可以看出,经过石灰、白矾炮制后的法半夏、姜半夏、清半夏中各成分有所损失,法半夏、姜半夏缺失第3、6、8号峰;清半夏中鸟苷大大减少。古法制半夏各个峰均较显著,成分损失小,说明古法制半夏的炮制方法对半夏的有效成分保留较多,而且避免石灰、白矾等对人体的毒副作用。

(2)在盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱成分的检测中对照品有检出,但各半夏炮制品样品中均未见盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱色谱峰,可能与盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱不易溶于水且不适合此检测方法有关。

(3)可能由于琥珀酸含量低,在检测时,其对照品分别在41.758、43.725、50.000出现了3个峰(见图6,扫描题目右侧二维码查看),主峰在41.758;样品检测中制半夏、法半夏、清半夏、姜半夏均未检出琥珀酸成分。分析原因在于半夏总有机酸中琥珀酸含量太低,琥珀酸成分的特征也不包含在上述特征图谱中。

4 讨论

半夏在临床上广泛运用于风寒湿痰、胃反呕吐、瘰疬、肿瘤等病证的治疗,但因其有毒,临床上对其应用须炮制后使用(如法半夏、姜半夏、清半夏等),且用量较小。对于此用法,近代名医姜春华认为现代半夏制法均“使半夏失却药性,成为淡而无味有名无实的药渣”[4]。山西名老中医李可教授认为现代制半夏药效较差”[5]。

本课题通过对用经方中半夏炮制方法制出的古法制半夏与用现代«中国药典»中半夏炮制方法制出的法半夏、姜半夏、清半夏进行有效成分测量及比较分析,以衡量经方中半夏的炮制方法对于药物有效成分的保留是否更为合理。

4.1 鸟苷含量分析 古法制半夏生品来源于山西夏县,自行加工炮制;法半夏、姜半夏、清半夏均从市场购买。由于本课题资金有限,药材质量层次不一,故可能导致检测用样品的鸟苷成分含量也不一致,仅凭一种鸟苷成分也不能全面反映半夏各炮制品的内外质量。为了准确反映各炮制品之间的质量差异,本课题组采用HPLC-UV色谱法建立了半夏炮制品特征图谱表征方法,在已建立的鸟苷含量测定的同时,测定尿苷、腺苷等10个特征峰图谱。研究发现,经过石灰、白矾炮制后的法半夏、姜半夏、清半夏中的10个特征峰缺失了第3、6、8号峰;清半夏中鸟苷含量大大减少,其他特征峰也比古法制半夏小;古法制半夏各个峰均较显著,成分损失小,古法制半夏的炮制方法对半夏的有效成分保留较多,说明经方中半夏的炮制方法对于药物有效成分的保留是合理的。此法操作简单,重复性好,为半夏炮制品的质量控制和评价提供了研究基础。

4.2 特征图谱分析 中药化学成分复杂多样,不同成分协同发挥药效作用。在质量指标成分不明确时,相关文献也仅限于对某一种或某几种指标成分进行定量测定,因此本实验在采用鸟苷含量测定的基础上,以鸟苷作为质量标志物,对半夏中核苷类成分采用HPLC,对不同方法炮制的半夏炮制品中水溶性成分进行色谱峰特征定位表征,同时确定了腺苷、尿苷的特征峰,这样可解决中药对照品不易获得且对多成分含量测定造成局限性的难题,从10个特征色谱峰的保留时间、数量、位置、大小以评判半夏各炮制品的质量优劣,从而得出古法制半夏的成分损失最少。

综合上述水溶性小分子成分的实验测量结果分析,经方中半夏的炮制方法“汤洗”对于半夏有效成分的保留要优于现代法半夏、姜半夏、清半夏的炮制方法,故建议增加古法制半夏的药典质量标准。这种定量与定性相结合的HPLC特征图谱表征测量方法操作简单,重复性好,为半夏炮制品的质量控制提供了方法支持,有利于半夏在治疗中发挥更好的作用。由于本课题基金有限,实验测量中存在样本数量少的不足,检测结果有待进一步完善与提高,希望能为临床更合理、有效地使用半夏提供参考依据。