增龄相关肌少性肥胖的生物信息学分析

付婉瑞，古再丽努尔·卡德尔，冯颖

复旦大学附属华东医院营养科，上海 200040

全球人口老龄化正在加剧。据联合国《世界人口展望（2019）》报告，预计2050年，全球65 岁以上和80岁以上人口将分别占总人口的16%和5%；而中国65岁以上人口接近总人口的30%。老年人数量的急剧增加，使增龄相关健康问题得到了越来越多的关注，包括因增龄相引起的身体成分变化，如骨量和肌肉量下降、脂肪量增加等。肌肉减少症（Sarcopenia），简称“肌少症”，是指与年龄相关的肌肉质量和力量下降，可能合并躯体功能的衰退［1］。据报道，在全球60 ～70岁人群中，肌少症的患病率为5%～13%，而80 岁及以上人群中，患病率可增至50%［2］。相较于老年人骨骼肌质量的增龄性下降，有研究发现，75 岁前体重和体质量指数（body mass index，BMI）通常表现为增加，且多在稳定一段时间后才开始下降［3］，这是因为骨骼肌质量的下降常伴随着脂肪量的增加，超重和肥胖可掩盖肌少症的早期变化［4］。进一步研究发现，肌少症和肥胖具有多种重叠的病因和反馈机制，且二者间具有协同作用［5］。由此，肌少性肥胖（Sarcopenic Obesity，SO）用以描述肌少症与肥胖共存的状态［6］。目前，SO的诊断标准尚未达成共识，故其流行病学尚不清楚；虽有多项SO 患病率的调研［7］，但患病率估计值存在较多差异，从0%至41%，多见于老年人群。众所周知，肌少症患者发生不良结局的风险可显著增加，包括跌倒、残疾、住院和死亡；而肌少症在肥胖患者中最容易被忽视，SO 发生不良结局的风险更大；但肌少症和肥胖都存在一定的可逆性，及早诊治可大大降低发生不良结局的风险。

SO 的病因复杂，发病机制目前尚不清楚，造成了治疗上的困难。寻找同时调控增龄、肌少症与肥胖的靶点途径，可使治疗事半功倍。本研究利用生物信息学方法对多组分子生物信息数据进行整合分析，旨在探讨SO 的发病机制与可能的治疗靶点，为增龄相关SO 的诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料

本研究分别以“Aging”、“Sarcopenia”、“Obesity”在NCBI 数据库（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／gene）、 GeneCards 数据库（https：／ ／www.genecards.org）、 Disgenet 数据库（https：／ ／www.disgenet.org／）、OMIM 数据库（https：／ ／www.omim.org／）进行检索，将结果分别进行汇总、去重，即得到该疾病的靶点基因，将以上三部分结果取交集之后便获得Aging-Sarcopenia-Obesity 共同的靶点基因。

1．2 方法

1．2．1 靶点基因功能注释及通路富集分析本研究将靶点基因输入DAVID 生物信息数据库（2021 Update） （ https：／ ／david.ncifcrf.gov／home.jsp）在线工具进行分析，并进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的富集分析，结果筛选以P＜0.01、 FDR ＜0.01 同时通路富集基因数＞3 为标准，GO 富集分析分为三个方面，分别是：分子功能（Molecular Function，MF）、生物学过程（Biological Process，BP） 和细胞组分（Cell Component，CC）。

1．2．2 蛋白质相互作用网络及关键基因的获取本研究将靶点基因输入STRINGv11.5 数据库（https：／ ／cn.string-db.org／）分析基因调控的蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI），将最低互作分值设置为置信度＞0.9（最高置信度），并且隐藏独立靶点。将结果导入Cytoscape 软件v3.7.1 进行PPI 网络可视化分析，再利用Cytohubba 插件计算各基因的节点值，保留节点值≥12 的结果，然后使用MCODE 插件对PPI 网络进行子网络模块分析。

1．2．3 预测靶点基因相关miRNAs 本研究使用ToppGene 数据库（https：／ ／toppgene.cchmc.org／）检索靶向所有共同靶点基因的miRNAs。参数设定：（1）Correction：FDR；（2） P-Value cut off：0.05；（3）GeneLimts：1≤n≤2 000；（4）Source：miRTarbase。

2 结果

2．1 共同靶点基因的获取

使用“Aging”、“Sarcopenia”、“Obesity”作为关键词，物种选择为“9606”（Homo Sapiens，智人）进行搜索，在NCBI 数据库中分别得到1 033、54、2 056 个结果，在GeneCards 数据库中分别得到26 415、266、9 227个结果，在Disgenet 数据库中分别得到1、164、2 821 个结果、在OMIM 数据库中分别得到364、8、317 个结果；将各部分的靶点基因进行汇总，去重，分别得到26 400、1 279、9 745 个结果；将各部分汇总结果取交集，得到984 个共同调节Aging-Sarcopenia-Obesity 的靶点基因，使用jvenn（http：／ ／jvenn.toulouse.inra.fr／app／example.html）进行结果可视化。见图1。

图1 Aging-Sarcopenia-Obesity 共同靶点基因的韦恩图

2．2 对共同靶点基因进行GO 富集和KEGG 分析

利用DAVID 生物信息数据库（2021 Update）对靶点基因分别进行GO 和pathway 分析。结果如图2 所示，GO 富集分析发现，靶基因的分子功能主要涉及蛋白结合等；生物学过程主要涉及增龄、药物应答以及缺氧应答等；细胞组分主要定位在胞浆、外泌体和细胞外等，KEGG 分析显示，靶点基因主要与肿瘤、PI3K-Akt 信号通路、肿瘤miRNAs 等通路有关。

图2 GO 和KEGG 分析

2．3 对共同靶点基因进行PPI 网络模块分析

本研究的PPI 分析共得到725 个蛋白6 854 对关系（图3）。将结果导入Cytoscape 软件并用Cytohubba插件计算出各基因的节点值（Degree），筛选得到节点值≥12 的基因357 个（图4）。其中，TP53、EP300、STAT3等基因的节点值最大，说明其在该网络中起着重要作用。此外，使用MCODE 插件构建及筛选具有统计学差异的子网络模块。结果显示，显著性最高的4 个模块为IL-6/STAT3、TP53、RELA（NF-κB 家族成员之一）、EP300网络（图5，score 得分越高，代表该子网络模块的作用越关键），各模块中的基因名称见表1。

图5 PPI 网络图中的子网络模块

表1 子网络模块的分析结果

2．4 对共同靶点基因进行miRNAs 预测分析

使用ToppGene 数据库预测miRNAs 的结果见表2（仅列出P值最小的前10 个结果）。本研究结果显示miR-26b-5p、 miR-155-5p、 miR-34a-5p 等miRNAs 最有可能影响增龄相关肌少性肥胖的疾病进程。

表2 miRNA 的预测结果

3 讨论

衰老的九大特征之一便是细胞衰老，代表着细胞增殖（生长）的不可逆终止，同时伴随多种表型变化，如释放许多生物活性分子：促炎细胞因子，趋化因子，生长调节因子，血管生成因子，蛋白酶，生物活性脂质，细胞外基质成分和基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMP），统称为衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype，SASP）［7-9］。在衰老过程中，脂肪炎症导致脂肪重新分布到腹腔内区域（内脏脂肪）和浸润到骨骼肌，脂质及其衍生物在肌肉细胞内和细胞间积聚，诱导线粒体功能障碍，干扰脂肪酸的β 氧化，增强活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的产生，导致脂质毒性和胰岛素抵抗，进一步增强促炎细胞因子的分泌。反过来，肌肉分泌的细胞因子可能会加剧脂肪组织萎缩，维持慢性低度炎症，并导致局部高脂血症，胰岛素抵抗和全身性炎症的恶性循环，从而促进SO 的发展［10］。到目前为止，尽管有大量的研究探讨骨骼肌与脂肪的关系，SO 发病机制仍未阐述清楚。

近年来，由于高通量生物技术的快速发展，从分子水平到临床层面产生的生物医学数据呈爆发增长，伴随而来的还有数以千计的生物信息数据库。这些数据库基本可以分为一次数据库和二次数据库两类，一次数据库主要归类整理了实验室的原始数据，而二次数据库主要依照特定物种、特定目的收集整理数据，其专业性更强，操作门槛更低，可以帮助更多的非计算机专业的研究者进行生物信息学分析。目前，以生信分析为目的构建的数据整合平台层出不穷，使生信分析变得更加简便，为解读基因信息、探究疾病机制、进行药物设计提供了巨大帮助，促进了当今生物医学和生物信息学的蓬勃发展。例如，DAVID 生物信息数据库是最常用最权威的基因功能注释工具之一，用于分析基因背后的生物学意义； STRING 数据库是拥有蛋白质相互作用信息最大的数据库之一。

本研究通过生物信息学技术，探讨增龄相关性肌少症和肥胖可能的共同发病机制。通过查询四大数据库，本研究共找到984 个调节增龄、肌少症、肥胖的靶基因。分析结果显示，增龄相关的细胞间通讯改变在SO 中发挥重要作用。

P53，由TP53 基因编码的蛋白，是众所周知的“基因组守护者”，可以通过几种不同的翻译后修饰机制（磷酸化、甲基化、乙酰化等）在细胞衰老中发挥关键作用。EP300 基因编码的P300 蛋白，是最广为人知的与P53 乙酰化相关的组蛋白乙酰转移酶之一。P53 和P300 在肌细胞行使正常功能中不可或缺，同时参与调节脂肪酸降解、脂质合成以及脂肪分化［11-14］。最新研究发现，当TP53 基因发生G 等位基因突变时，SO 患病风险增加［15］。

P53 和P300 除直接调控细胞的增殖分化与代谢外，还参与调节SASP。总所周知，白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）是SASP 主要成分之一，它在正常衰老过程中的表达增加，是衰老的加速器。IL-6 表达受到核因子Kappa B（Nuclear Factor-KappaB，NF-κB）调控，而NF-κB 和P53 通路之间的相互拮抗，P300 可以通过NF-κB 促进IL-6 转录［16-17］。IL-6 可以通过JAK／ STAT3 途径调控衰老，其主要机制包括与P53 和P21 的启动子结合，以及与其他途径（如P300 -CBP、NF-κB）相互作用［18-19］。最新研究表明，IL-6／STAT3通路可以促使白色脂肪组织产热增加和脂肪分解的上调，而抑制该途径可抑制前脂肪细胞的SASP 以及SASP 在体外诱导的脂肪组织炎症［20-21］。IL-6 在骨骼肌蛋白质稳态的调节中具有双向作用。全身性IL-6的急性增加会促进肌肉生长和肥大，但其持续升高（如癌症或糖尿病）会导致肌肉萎缩［22-23］。已有研究报道，SO 患者比正常人以及仅为肌少症的患者具有更高的IL-6 水平［24］。

MiRNAs，非编码的短小的RNA，可以经由细胞分泌到血液循环中，介导细胞间和组织器官间的信息传递。据报道［25］，衰老会改变肌肉中的miRNAs 水平，这些变化可能对肌肉的质量和数量产生不利影响。来自啮齿类动物的研究证据表明，脂肪衍生的miRNAs 可通过外泌体运输到各种宿主细胞，包括肌细胞，肝细胞和巨噬细胞；同样，骨骼肌衍生的miRNAs可被脂肪组织吸收［25］。miRNAs 的这种串扰机制使得其成为增龄相关肌少性肥胖的潜在治疗靶点。本研究预测miR-26b-5p、 miR-155-5p、 miR-34a-5p 等miRNAs 在增龄相关肌少性肥胖发生发展中可能发挥着重要作用，而已有研究表明，miR-26b 是脂肪生成所必需的，它可以通过靶向ADAM 金属肽酶结构域17（ADAM Metallopeptidase Domain 17，ADAM17）增加脂质积累［26］，通过靶向磷酸酶和张力蛋白同源物（Phosphatase and Tensin Homolog，PTEN）诱导细胞分化［27］。一项对老年肌少症患者血浆的检测发现miR-155 含量降低［28］。总的来说，miRNAs 分别在肥胖、肌少症领域有初步的探索，但仍缺乏足够的证据阐明其机制，在增龄相关肌少性肥胖中更需要进一步的研究。

生活方式干预是预防和治疗增龄相关SO 的有效基本策略，适宜的有氧运动、抗阻训练联合膳食调整可明显改善老年SO 患者的身体功能。骨骼肌和脂肪间的通讯改变无疑在其中起着重要作用，但调控机制尚不清楚。本研究发现P53、 P300、 IL-6／STAT3 通路、 miR-26b-5p 等miRNAs 以及它们参与的SASP 调节可能在增龄相关SO 发生发展中起着重要作用，为进一步解析及诊疗增龄相关SO 提供了线索。由于本研究是运用数据库及生物信息学分析手段进行的探索性工作，研究结果仍需在后续实验中进一步验证。