磷脂酶D特性及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用

郭碧珊，张梦雪，王鋆坦，杜 瑞，朱海华,2, ，许 君，王法云,2，王 慧,4

（1.河南省商业科学研究所有限责任公司，河南郑州 450002；2.河南省食品质量安全控制工程技术研究中心，河南郑州 450002；3.河南农业大学生命科学学院，河南郑州 450002；4.上海交通大学医学院公共卫生学院，上海 200025）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）作为构成机体神经组织细胞的基本磷脂类物质，是脑细胞信息读取，传递和记忆的重要介质[1]，被誉为“大脑维生素[2]”。PS具有预防老年痴呆[3]，改善大脑记忆，缓解抑郁症，提高儿童注意力[4]等功效。因此，PS被列为新资源食品和功能性食品，在保健食品、化妆品以及制药工业中得到广泛应用[5]。PS的制备方法主要有化学合成法、溶剂萃取法和酶法合成。其中化学合成法和溶剂萃取法因工艺复杂、环境不友好、产率低、纯化困难等不适用于大规模工业化生产，而酶法合成因反应条件温和、环境友好、PS产量大、成本低等优点而备受关注[6-8]。磷脂酶D（Phospholipase D，PLD，EC 3.1.4.4）是酶法合成PS的关键酶，其属于磷酸二酯酶超家族成员[9]，不仅可以将磷脂酰胆碱水解生成磷脂酸（Phosphatidic acid，PA），也可通过转磷脂酰化合成PS等稀有磷脂[10-11]。PLD在植物、动物和微生物中无处不在，其中微生物PLD由于较高的催化性能和简单的纯化过程成为目前PS生产中使用最广泛的酶[6,12-13]。

近年来微生物PLD的研究主要集中在反应体系优化以及酶的重复使用上。黄琳等[14]通过重组表达获得PLD，优化单水相中PS生成条件，使其产率达33%；Liu等[15]通过将PLD表面展示到毕赤酵母表面实现酶的重复利用，继而优化纯水体系中PS的生成条件，最终转化率达53%； Zhang等[16]将PLD固定化到-C18修饰的有序中孔二氧化硅立方体（OMSC）中，优化两相体系中PS的生成条件，转化率高达91.2%。大量文献表明，无论PLD酶以何种形式发挥作用，反应体系的不同对PS产率有很大影响。因此，对PLD催化制备PS的反应体系进行研究很有必要。

本文对微生物PLD的特性及其在制备磷脂酰丝氨酸方面的应用进展进行了综述，并重点介绍了不同的反应体系下PLD催化生产PS的差异，为PS的绿色高效生产提供理论指导，从而加快PS在功能食品中的开发和应用，促进我国大健康产业的发展。

1 微生物PLD的特性

1.1 PLD的分子结构特点

PLD作为磷脂酶超家族成员，具有该家族的明显特征：高度一致的保守序列HxKxxxxD，该保守序列是催化水解的活性部位。Hough[17]在2000年首次解析出了链霉菌PMF-PLD的三维结构（图1）。该酶分子结构呈双叶型，两个HKD保守序列沿着对称轴彼此相邻。两个结构域单体由三十五个二级结构组成，呈α-β-α-β-α状排列，每个β链包括8～9个β折叠，两侧含有18个α螺旋。在二聚体界面上存在一个30 Å孔径的活性位点以方便底物进入，两个柔性环延伸到活性位点的入口上方，从而可以调节界面脂质的相互作用。

图 1 链霉菌PMF-PLD的三维蛋白结构Fig.1 Tertiary structures of PMF-PLD

1.2 PLD的催化机理

PLD是具有特殊性质的酯键水解酶，具备水解磷酸二酯键和碱基互换的能力。一方面它能催化水解磷脂分子中的磷酸和有机碱（如胆碱、乙醇胺等）羟基成酯的键，释放原来磷脂的极性头部，生成磷脂酸和羟基化合物胆碱；另一方面，除水解作用外还能催化一些含羟基的化合物与磷脂的碱基进行碱基交换反应，生成新的磷脂。利用此特性可对磷脂进行改性，以富含磷脂酰胆碱的磷脂为底物，进行磷脂酰基转移反应，可为大量制备稀有磷脂和纯化单体磷脂提供有效的途径（图2）[18]。

图 2 磷脂酶D的催化反应Fig.2 Phospholipase D-catalyzed reaction

1.3 PLD的底物特异性

PLD酶因其来源及结构不同，其底物特异性也不同，可作用于含有不同头部基团的磷脂。且在转酯反应中，受体醇与水分子互为竞争关系，因此，不同来源PLD的转酯能力取决于两个HKD模块的化学和空间环境。与动植物来源的PLD相比，微生物来源的PLD有更强的转酰能力以及更为广泛的底物选择谱，其中，链霉菌来源的PLD与其它来源PLD相比，由于呈现出最紧密的结构，且转酯与水解能力之比相对较高，而被广泛研究[19]。

即使酶来源相同，同种PLD酶的底物特异性也不同，其水解和转酯活力受底物多种因素影响：磷脂酰基链组成、头部醇的结构尺寸以及底物聚合形态。通常脂肪酸中含有6～8个碳原子的酰基链比更长链具有更快的催化速率，对卷心菜和罂粟重组PLD同工酶的研究表明，氨基酸的少量变化也可导致水解和转酯活性的显著变化[20]。Dippe等[21]通过定点饱和酪氨酸残基突变研究发现，头部醇尺寸越小越有利于酶与底物结合并发挥作用。Dawson等[22]对菠萝PLD催化多种聚合形态底物进行研究，发现底物以小聚合状态存在时，PLD催化能力较强。

1.4 影响PLD活力的因素

影响PLD活力的因素有很多，包括温度、pH、盐类、溶剂以及反应体系等[23]。PLD最适温度和pH受其来源影响较大：大多数PLD的最适催化温度为25～45 °C，部分在55～60 °C时活力最高[24]；来源于植物的PLD最适pH在5～6之间，微生物来源的范围较宽，在4～8之间。盐对酶活性的影响也较显著。研究表明，对PLD催化反应影响最显著的为钙离子[25]，钙离子不仅能激发PLD的催化活力，而且能提高其热稳定性；TritionX-100等具有乳化作用的盐也能提高PLD的活性[26]；除此之外，还有Mg2+、Mn2+、Fe2+等均影响PLD酶活，酶来源不同，离子对其活性作用不同。不同体系中PLD表现的活力也不同，PLD对水溶性底物的作用比较缓慢，而在油-水界面上作用较好。因此，增加油-水界面条件和有利于酶吸附在界面的因素，可提高酶活力，增加催化反应速率。

2 微生物PLD催化制备磷脂酰丝氨酸研究

PS是从牛脑中发现并被定性的[27]。在PS的结构组成中，带有负电荷的头部为亲水性，而由脂肪酸组成的尾部为亲脂性[28]。不同来源的PS其脂酰残基差别较大，因此PS是混合物，不是单一成分。而该性质也决定了PS制备方法的多样性，主要包括化学合成法、溶剂提取法和PLD酶转化法。

化学合成法和溶剂提取法属于非酶催化法。化学合成工艺复杂，成本较高，且合成结束会出现有机溶剂浓缩回收以及合成产品中溶剂残留问题，易使PS受到污染；溶剂提取法有机溶剂消耗量大，获得的PS纯度低，且由于“疯牛病”的流行，其安全性受到质疑，已经逐渐被淘汰[29]。因此，这两种方法均不符合我国大健康产业的发展和国民绿色健康的理念。而PLD酶法制备磷脂酰丝氨酸既环保又安全，已经成为生产PS的理想方法[30]。

2.1 PLD酶催化法制备磷脂酰丝氨酸

酶催化法是指底物PC和L-丝氨酸在PLD的作用下生成PS。酶催化法具有反应条件温和、反应易控、高效简单等优势，逐渐得到广泛的研究及应用。由于底物PC和产物PS易溶于有机相，而PLD和L-丝氨酸易溶于水相，造就了PS制备体系的多样性，这些体系主要包括单相反应体系、两相反应体系和新型环保溶剂反应体系。因此，该研究进展对PS生产的反应体系进行了总结。

2.1.1 单相反应体系

2.1.1.1 传统单相反应体系 传统单相反应体系即反应只在水相中进行，全程没有有机溶剂的使用。由于卵磷脂的双亲性，反应液多为均质胶或悬浊液状态。一般是先将底物卵磷脂利用均质设备打散，然后在丝氨酸和酶的作用下共同反应。黄琳等[14]利用重组PLD在单水相体系中催化大豆卵磷脂进行转酯酰反应，6 h后PS产率可达33%；黄婷婷[31]优化纯水相中生产PS工艺，以PC60为底物，反应6 h后，PS转化率可达到96.7%，副产物PA仅生成0.2%，实现了底物向产物高效转化。但不可否认，单水相中水的存在会导致PLD的水解活性增强，因此需要进一步优化条件以降低PC的水解率及提高PS的生成率。

一方面是调整PC与水的比例和丝氨酸的浓度等条件，一方面是利用硫酸钙和硅胶作为吸附载体吸附底物PC进行酶转化。Zhang等[32]研究了两种PC吸附模型：TritonX-100与二氧化硅共价结合模型和二氧化硅吸附PC模型。两种模型被成功用于纯水相中PLD介导的转磷脂酰反应，PC装载量达到98.9%，PS收益率达到99.0%，为PS的连续生物合成提供了一种很有前景的方法。

2.1.1.2 固定化酶单相反应体系 到目前为止，固定化PLD已在多种有机溶剂（如乙醚、氯仿、甲苯）中进行转磷脂酰化反应，以达到PS的最大产率[33]。但是有机溶剂具有易燃性、挥发性和毒性，使其生产的PS难以应用在功能食品和医药制品中，因此提高单水相中转酯反应的效率势在必行。Mao等[34]将PLD固定在环氧基载体上，在纯水溶液中采用固定化PLD合成PS，转化率65%，整个过程避免了有机溶剂的影响，由于其具有安全性，且产品回收过程简单，因此在PS的工业生产中具有广阔的前景。

2.1.2 两相反应体系

2.1.2.1 传统两相反应体系 传统的两相反应体系为水-有机溶剂体系。在两相体系中，转酯反应和水解反应同时进行，且水解反应会影响目的产物PS的生成。一方面有机溶剂会与水化层发生作用，影响酶的活力，另一方面水的存在会导致水解副产物PA大量生成，降低PS生成率。因此，Chen等[6]首次利用含水量为6.25%（V/V）的微水相-有机溶剂两相体系，通过减少水的存在来抑制水解反应；冯小娜等[35]则是利用蛋白质工程改造策略扩大底物PC催化通道，降低位阻效应，同时提高活性位点与丝氨酸的亲和力，降低水解反应的同时提高了PS生成率。

两相反应体系的酶转化研究集中在有机相种类选择、两相体积比、PC与丝氨酸质量比、反应温度、pH等方面。表1总结了目前一些具有代表性的研究结果。

2.1.2.2 固定化酶两相反应体系 Wu等[40]制备了一种新型的固定化PLD的环氧树脂基纳米复合材料。固定化酶在正庚烷为有机相，磷酸盐缓冲液为水相的反应体系中，实现了底物PC的高转化，转化率达96.2%；Liu等[7]利用基因工程和分子生物技术将PLD成功展示在毕赤酵母表面，在乙醚为有机相，乙酸钠缓冲液为水相的反应体系中，PC转化率为67.5%。固定化酶可增强PLD的稳定性和可重复使用性，表面展示系统还避免了酶的分离纯化，具有极大的工业化生产潜力。

二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）是长链多不饱和脂肪酸，主要存在于海洋微生物、动物和浮游植物体内，具有极好的营养保健功能。Zhou等[41]从鲱鱼卵中提取富含DHA的磷脂酰胆碱（DHA-PC），合成DHA-PS；于刚等[42]以鱿鱼卵磷脂为原料，利用PLD酶法合成富含EPA和DHA的PS。然而酶法合成用到的有机溶剂具有一定的毒性，浓缩回收过程中加热时间过长也会导致热敏性PS的过氧化值过高。因此两相反应体系生产的PS不适合添加到食品、医药中，所以生物安全型、环境友好型试剂被逐渐研发用于PS的合成。

2.1.3 绿色环保溶剂反应体系 水单相反应体系会使反应向有利于水解反应的方向进行，造成副产物PA的大量生成；传统两相反应体系所用有机溶剂有毒，生成的PS不适合添加到食品、医药中。因此，各种绿色生物质溶剂应运而生。如γ-戊内酯[43-44]、脂肪酸甲酯[45]、柠檬烯[46]、离子液体[47]、深共晶溶剂[48-49]和2-甲基四氢呋喃[44]等，在实现对环境无污染无毒的同时，也保证了PLD催化的转磷脂酰反应具有70%～95%的转化率。因此随着人们健康理念的深入，绿色生物质溶剂将具有极大的市场前景。

综上，PLD酶催化法制备PS的反应体系可细分为五类，表2对这几种反应体系的特点进行了总结。总体而言，目前对单水相和有机相/水相双相系统的研究较多，其PS产率整体上可达到较高的水平。绿色生物质溶剂虽有其独特的优势，但是因为其属于新型溶剂，目前对这类化合物的研究应用还不是很多，和传统的有机溶剂相比究竟哪个具有更高的人体安全性尚无定论，因此未来仍要着重探索PLD酶在新型溶剂中的催化机理。

表2 不同反应体系的特点Table 2 Characteristics of different reaction systems

3 总结与展望

随着我国大健康产业的发展以及“健康中国”、“绿色产业”的理念倡导，国民营养健康的需求会越来越多。磷脂酰丝氨酸作为一种新型食品资源，在改善老年人记忆力、治疗抑郁症和儿童多动症等方面具有重要作用，因此高纯度的PS在功能食品和保健食品中市场潜力巨大。本文主要对微生物PLD酶法制备PS的不同反应体系进行了综述。总体而言，虽然在单相体系纯水溶液中PS的生成率一般低于水-有机溶剂两相体系中的生成率，但是要实现PS在功能食品和医药制品中的安全应用，在纯水溶液中生产PS是大势所趋，未来仍是研究方向的重点。建议一方面在PS生成过程中，选择合适的载体，吸附底物PC或将PLD酶固定化，提高酶的利用率，实现PS的连续生物合成，降低PS生产成本。另一方面筛选出高转磷脂活性酶的微生物，降低PLD的生产成本，并利用生物技术手段从分子层面出发，提高PLD的转酯效率，并继续验证新型绿色环保溶剂的毒理学评价。相信在研究人员的共同努力下，PLD的相关研究能够为加快PS在功能食品新产品中的开发和应用奠定基础，为国民健康保驾护航。