长链非编码RNA淋巴细胞白血病缺失基因2对舌鳞癌细胞增殖和侵袭的调控作用

冯维，尚张丽，吴丽玮

舌鳞癌是一种起源于舌复层鳞状上皮的头颈部恶性肿瘤，具有恶性程度高、易发生远处转移和预后效果差等特点；尽管手术、放疗和化疗等医疗手段有了很大的进步，但大部分病人5年总生存率并不理想［1-2］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种不具有编码蛋白质，与肿瘤的发生密切相关［3］。目前，已发现多种与舌鳞癌恶性演变密切相关的lncRNA，包括AFAP1-AS1、MALAT-1和TUG-1等［4-5］。有学者采用affymetrix软件在舌鳞癌组织中筛选出一些差异性表达的ln‐cRNA，其中淋巴细胞白血病缺失基因2（DLEU2）呈现低表达［6］。关于DLEU2在肿瘤如非小细胞肺癌、胃癌和黑色素瘤［7-9］等方面的功能研究已有报道，但DLEU2在舌鳞癌中的作用并不清楚。因此，本研究通过观察DLEU2在舌鳞癌组织和细胞中的表达水平，及其对舌鳞癌细胞增殖和侵袭影响。

1 材料与方法

1.1材料2018年5月至2019年7月收集在邯郸市第三医院行手术治疗的22例舌鳞癌组织及对应的癌旁组织标本，病理诊断均为鳞状细胞癌，病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

人正常口腔黏膜细胞株HOK和3种舌鳞癌细胞株CAL-27、SCC-15和SCC-4（美国ATCC），pcD‐NA3.1-DLEU2过表达载体及pcDNA3.1空载体（中美泰和生物科技公司），DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜和噻唑蓝（MTT）（北京索莱宝科技公司），胎牛血清（四季青公司），反转录试剂盒（美国Fermentas公司），脂质体2000和Trizol试剂（美国Invitrogen公司）。Tranwell小室（康宁公司），二氧化碳培养箱（美国Forma公司），倒置显微镜（日本Olympus公司），紫外分光光度计和酶标仪（美国Thermo公司），实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.2细胞培养用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%二氧化碳培养箱中常规培养CAL-27、SCC-15、SCC-4和HOK细胞。

1.3实时荧光定量PCR检测DLEU2的表达采用Trizol法提取舌鳞癌组织、癌旁组织和CAL-27、SCC-15、SCC-4、HOK细胞的总RNA后，紫外分光光度计检测RNA浓度与纯度。反转录结束后，以其为模板，根据上海生工合成的PCR引物（DLEU2正向引物：5'-TCTGGAGAACAGCCTCACTTC-3'，反向引物：5'-TGCTGAGCTAAGTAGAGGTCTC-3'；GAPDH正向引物：5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，反向引物：5'-TTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'）上PCR仪进行扩增。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，2−ΔΔCt法计算舌鳞癌组织和细胞中DLEU2的表达水平。实验重复3次。

1.4实验分组和转染将对数期的CAL-27细胞，接种至6孔细胞板上，分为对照组（未转染）、空载体组（转染pcDNA3.1空载体AGUAGCUACGCCCCU‐ACGUUU）和DLEU2组（转染pcDNA3.1-DLEU2过表达载体UGCGUAUCACCCCCUGAUACGAUGCU‐AC），待细胞培养至70%汇合度时，参照脂质体2000说明书步骤，将无血清培养基稀释4μg载体质粒与10μL脂质体2000混合物根据实验分组加入到CAL-27细胞中，而对照组加入等量的培养基。继续培养48 h后，收集各组细胞并采用“1.3”方法检测各组细胞中DLEU2的表达水平。

1.5MTT法检测细胞增殖将对照组、空载体组和DLEU2组细胞接种至96孔细胞板上，培养48 h，每孔加5 g/L MTT试剂20μL。孵育4 h，弃上清液，每孔中加150μL二甲基亚砜。震荡反应15 min后，使用酶标仪在450 nm波长处检测各组细胞的吸光度。每组设置3个平行孔，实验重复3次。

1.6Transwell实验检测细胞侵袭将转染48 h对照组、空载体组和DLEU2组细胞，加无血清的培养基孵育24 h。加入0.25%胰蛋白酶消化，并将各组细胞浓度调整为3×104个/毫升。经无血清培养基稀释工基质胶（1∶6比例）平铺Transwell小室，Tran‐swell小室放24孔细胞板内，上室加200μL细胞悬液，下室加600μL含血清的培养基。培养24 h，以棉签小心擦去上室中残留的细胞，4%多聚甲醛固定30 min，再以0.5%结晶紫染色15 min。在200倍显微镜下观察并统计穿膜细胞数，实验重复3次。

1.7统计学方法实验数据以±s形式表示，采用SPSS 22.0进行统计学分析。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1DLEU2在舌鳞癌组织和细胞中的表达实时荧光定量PCR检测22例舌鳞癌组织中DLEU2的相对表达量（0.30±0.02）较正常癌旁组织（1.00±0.00）明显降低（t=39.00，P<0.001）；同时检测人正常口腔黏膜HOK细胞和3种舌鳞癌SCC-15、SCC-4、CAL-27细胞中DLEU2的相对表达量分别为（1.00±0.00）、（0.35±0.04）、（0.48±0.04）和（0.26±0.03），F=961.39，P<0.001。与HOK细胞相比，SCC-15、SCC-4和CAL-27细胞中DLEU2的表达水平均明显降低（均P<0.001），且DLEU2在CAL-27细胞中的表达水平最低。故后续以CAL-27细胞作为研究对象进行实验。

2.2转染后舌鳞癌CAL-27细胞中DLEU2的表达对照组（1.00±0.00）、空载体组（0.94±0.06）、DLEU2组（4.15±0.38）DLEU2表达水平比较，F=615.11，P<0.001；与对照组相比，DLEU2组明显降低（P<0.05），空载体组差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3DLEU2对舌鳞癌CAL-27细胞增殖的影响DLEU2组增殖活力较对照组明显降低（P<0.05），但空载体组和对照组细胞增殖活力差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 各组舌鳞癌细胞吸光度比较/±s

表1 各组舌鳞癌细胞吸光度比较/±s

注：DLEU2为淋巴细胞白血病缺失基因2。①与对照组比较，P<0.05。

组别对照组空载体组DLEU2组F值P值重复次数9 9 9 24 h 0.32±0.03 0.34±0.02 0.31±0.03 2.86 0.077 48 h 0.67±0.04 0.65±0.03 0.41±0.03①166.24<0.001 72 h 0.85±0.06 0.88±0.05 0.57±0.03①112.76<0.001 96 h 1.16±0.08 1.23±0.11 0.76±0.05①82.67<0.001

2.4DLEU2对舌鳞癌CAL-27细胞侵袭的影响对照组（125.85±10.50）、空载体组（136.32±12.63）、DLEU2组（57.28±6.35）穿膜细胞数比较，F=160.48，P<0.001；与对照组相比，空载体组差异无统计学意义（P>0.05），DLEU2组明显减少（P<0.05），表明细胞侵袭能力明显减弱。见图1。

图1 Transwell小室检测各组细胞的侵袭结果（结晶紫染色×200）

3 讨论

口腔癌是全球常见的第十一大恶性肿瘤，每年约有14.5万人因其死亡，而36.9万新发病例中有2/3发生在发展中国家；尽管口腔癌的发病率总体上有所下降，但其常见的病理类型舌癌的发病率却在增加［10］。舌鳞癌是舌癌最常见的病理类型，约占其80%以上［11］。因此，深入探讨舌鳞癌的发病机制寻找有效的治疗靶点尤为重要。

在舌鳞癌中存在异常表达的lncRNAs，且舌鳞癌的恶性演变与lncRNAs有着密切联系。例如：Jia等［12］研究发现，lncRNA FALEC在舌鳞癌组织中表达下调，FALEC过表达可通过EZH2沉默细胞外基质蛋白1（ECM1）抑制舌鳞癌细胞增殖和转移。ln‐cRNA MALAT1在舌鳞癌组织和细胞中异常高表达，而敲低其表达可通过抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路进而抑制癌细胞增殖、侵袭和迁移［13］。Ma等［14］报道，异常高表达的lncRNA GIHCG可通过负向调节miR-429参与细胞周期、增殖和迁移等促进舌鳞癌的恶性进展。这些研究表明，lncRNAs参与了舌鳞癌的发生与发展，研究舌鳞癌相关lncRNA的作用有助于深入了解舌鳞癌的发病机制，为舌鳞癌的治疗提供新线索。

lncRNA DLEU2是lncRNAs家族成员，也是miR-15a/16-1簇的宿主基因，定位于13q14染色体上，可介导参与细胞增殖和侵袭等生物学过程。张欢等［15］报道，在宫颈癌组织和细胞中DLEU2低表达，上调DLEU2可抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭。Xie等［16］在喉癌的研究中发现DLEU2异常低表达，而DLEU2过表达可通过调控miR-16-1减弱癌细胞增殖和侵袭能力。DLEU2除了在宫颈癌和喉癌中发挥着抑癌作用外，还在其他肿瘤中扮演着致癌基因的角色。Xu等［17］在胰腺癌组织和细胞中发现DLEU2异常高表达，DLEU2过表达可通过调控miR-455/Smad2促进癌细胞增殖和侵袭。Xie等［18］研究指出，DLEU2在胶质瘤组织和细胞中表达上调，可通过靶向miR-186 5p/PDK3促进胶质瘤恶性进展。可见，DLEU2有望成为肿瘤治疗的潜在靶点。

郭继平等［6］在舌鳞癌相关lncRNA的筛选与分析中报道DLEU2在舌鳞癌中表达下调。本研究通过检测22例舌鳞癌组织和3种舌鳞癌细胞进一步验证了DLEU2在舌鳞癌中的低表达结果。这提示，DLEU2可能在舌鳞癌中发挥着重要作用。本研究通过成功上调舌鳞癌CAL-27细胞中DLEU2表达后发现，CAL-27细胞增殖和侵袭能力明显减弱。结果表明，DLEU2可抑制舌鳞癌CAL-27细胞增殖和侵袭。提示，DLEU2在舌鳞癌中可能通过调控细胞增殖和侵袭发挥抑癌作用。

综上所述，lncRNA DLEU2在舌鳞癌组织和细胞中低表达，上调其表达可抑制舌鳞癌CAL-27细胞增殖和侵袭。该结果进一步揭示了舌鳞癌的发病机制，也为关于DLEU2在舌鳞癌中的机制研究奠定基础。后续将研究内容放在DLEU2调控的靶基因和信号通路上，进一步揭示DLEU2在舌鳞癌中的调控机制，以期为舌鳞癌的靶向治疗提供新线索。