膝骨关节炎关节液和滑膜中微小RNA-140-5p的表达及临床意义

张海英，郑晨颖

骨关节炎是多发于中老年的退行性疾病，随着人口老龄化的加剧，骨关节炎的发病率有持续上升的趋势，骨关节炎以关节疼痛、活动功能受限等为临床表现，严重影响病人日常生活质量，目前发病机制尚未阐明［1］。当前骨关节炎诊断主要依靠以软骨形态学变化为基础的磁共振成像、超声检查及关节镜技术，存在滞后性、创伤性等限制，确诊时骨关节炎病人关节软骨往往已经发生不同程度损伤，因此寻找骨关节炎的有效早期诊断指标对于早期干预以延缓病情，预防关节发生不可逆的退变是非常重要的［2-3］。微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是机体内源性非编码单链RNA，可在转录后水平调控其靶基因的表达，与多种自身免疫疾病有关，已有研究表明miR-140-5p在关节炎病人外周血、关节液中表达异常［4-5］，膝骨关节 炎（knee osteoarthritis，KOA）病人滑膜中的miR-140-5p的研究较少。本研究旨在探讨KOA病人关节液、滑膜中miR-140-5p的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料选取北京中医药大学东方医院2018年5月至2019年5月收治的51例进行膝关节关节镜或关节置换术治疗的KOA病人为观察组，年龄范围为41～75岁。依据凯尔格伦-劳伦斯（Kell‐gren-Lawrence，K-L）X线影像学分级标准将观察组分为3个亚组：KOAⅡ组（12例）、KOAⅢ组（24例）、KOAⅣ组（15例），其中Ⅱ级为明确骨赘；Ⅲ级为多发骨赘，伴关节间隙中度变窄；Ⅳ级为巨大骨赘，伴关节间隙严重变窄及软骨下骨硬化［6］。纳入标准：（1）符合中华医学会制定的KOA诊断标准［7］；（2）K-L分级为Ⅱ～Ⅳ级；（3）近3个月未经药物治疗；（4）近3个月无膝关节外伤。排除标准：（1）合并心、肝、肾等重要器官疾病者；（2）合并其他自身免疫性疾病者；（3）妊娠、哺乳期妇女。另外选取在该院进行截肢手术或因急性损伤进行关节镜治疗的55例无骨关节炎病人作为对照组，年龄范围为43～73岁。观察组、对照组均于术中收集关节液及滑膜，所有标本均在手术室进行预处理，后置于−80℃超低温冰箱中保存待测。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2方法采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测关节液和滑膜中miR-140-5p（仪器：Roche LightCycler 480Ⅱ型）。关节液离心（2 000 r/min，10 min）去除细胞与组织碎片，上清液于−80℃保存待测；术中收集的滑膜放入无菌管中，置入液氮中速冻，后在−80℃超低温冰箱保存待测。采用Trizol法提取总RNA，反转录为互补DNA（cD‐NA），进行扩增反应，反应条件：95℃预变性30 s，95℃5 s，60℃34 s，40个循环，miR-140-5p正向引物：5'-TGTGTCTCTCTCTGTGTCCTG-3'，反向引物：5'-GGTATCCTGTCCGTGGTTCTA-3'，U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AAC‐GCTTCACGAATTTGCGT-3'，试剂盒均购于上海生工生物工程有限公司，严格按照说明书操作。用2−ΔΔCt法计算关节液和滑膜中miR-140-5p的表达。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以±s表示，两组间差异比较采用两独立样本t检验，三组间差异比较采用单因素方差分析，进一步多组间的两两比较采用LSD法；计数资料以例表示，采用χ2检验比较；采用Spearman相关性分析检验两变量的相关关系；采用受试者工作特征（ROC）曲线探讨关节液、滑膜中miR-140-5p对KOA的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组一般资料比较两组性别、年龄、体质量指数相比，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 对照组（无骨关节炎）与观察组（膝骨关节炎）一般资料比较

2.2两组关节液、滑膜中miR-140-5p表达比较对照组关节液和滑膜中miR-140-5p表达量分别为（1.08±0.38）、（1.54±0.35），观察组关节液和滑膜中miR-140-5p表 达 量 分 别 为（0.51±0.16）、（0.67±0.21）。与对照组相比，观察组关节液、滑膜中miR-140-5p表达均较低（t=8.88，P<0.001；t=15.37，P<0.001）。

2.3观察组各亚组关节液、滑膜中miR-140-5p表达比较与KOAⅡ组相比，KOAⅢ组、KOAⅣ组关节液、滑膜中miR-140-5p均较低（P<0.05），与KOAⅢ组相比，KOAⅣ组关节液、滑膜中miR-140-5p均较低（P<0.05），见表2。

表2 观察组（膝骨关节炎）各亚组关节液、滑膜中miR-140-5p表达比较/±s

表2 观察组（膝骨关节炎）各亚组关节液、滑膜中miR-140-5p表达比较/±s

注：KOA为膝骨关节炎。①与KOAⅡ组相比，P<0.05。②与KOAⅢ组相比，P<0.05。

组别KOAⅡ组KOAⅢ组KOAⅣ组F值P值例数12 24 15 miR-140-5p关节液0.65±0.17 0.51±0.14①0.42±0.12①②8.77 0.001滑膜0.86±0.22 0.69±0.15①0.49±0.13①②17.33<0.001

2.4KOA病人关节液、滑膜miR-140-5p与K-L分级相关性分析Spearman分析结果显示，KOA病人关节液、滑膜miR-140-5p与K-L分级均呈负相关（r=−0.56，P<0.001；r=−0.68，P<0.001）。

2.5关节液、滑膜miR-140-5p对KOA的诊断价值ROC结果显示，关节液、滑膜miR-140-5p诊断KOA的曲线下面积（AUC）95%CI分别为0.913（0.855，0.972）、0.931（0.873，0.988），截断值分别是0.78、1.05，灵敏度、特异度、准确度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别为98.04%、78.18%、87.74%、0.76、80.65%、97.73%、4.49、0.03，96.08%、89.09%、92.45%、0.85、89.09%、96.08%、8.81、0.04。

3 讨论

骨关节炎以软骨退变、滑膜炎症为主要特点，发病呈进行性发展，KOA是最常见类型［8-9］。软骨组织由软骨细胞、软骨细胞外基质组成，KOA的病理过程主要是关节软骨细胞外基质合成与降解功能失衡，引起软骨细胞凋亡，最终导致软骨退变、丢失及软骨下骨硬化［10］。软骨细胞外基质由软骨组织唯一细胞类型软骨细胞表达分泌，主要由蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白组成，对软骨维持正常功能起重要作用，已有研究表明骨关节炎病人基质金属蛋白酶（MMP）-13呈高表达，对蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白有强降解功能，带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶-5（a disinterring and me‐talloproteinase with thrombospondin motifs 5，AD‐AMTS-5）在降解蛋白聚糖中起到重要作用［11-12］。有研究从RNA表达层面对KOA的发病机制作出阐述，报道表明β-连环素（β-catenin）与核因子-κB（NF-κB）信号通路可能通过共同调控下游炎性因子白细胞介素（IL）-1β的表达参与滑膜炎症反应［13］。

miRNAs可通过调控转录后基因表达参与机体炎症反应、肿瘤、心血管疾病等，一个miRNA可调控多达上百个靶基因的表达［14］。已有研究表明miR‐NA在多种类型关节炎病人中呈异常表达［4，15-16］，miR-140由miR-140-3p、miR-140-5p组成，具有调控软骨稳态的作用，与关节炎的发生密切相关［5］。韩朝永［17］研究发现，与健康对照者相比，KOA病人关节液中miR-140呈低表达，与K-L分级存在相关性。殷春明、潘晓华［18］研究表明，miR-140-3p参与骨关节炎的发生，与病情发展呈负相关。滑膜成纤维细胞的主要生理作用是为关节腔提供营养物质，以及为周围软骨提供润滑环境，类风湿关节炎病人滑膜增生、炎性因子过量蓄积。程龙等［19］研究发现，在体外将miR-140-5p以脂质体2000为载体转染到类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中，滑膜成纤维细胞的促炎性因子Toll样受体4表达降低，致使滑膜成纤维细胞增殖及侵袭能力降低。本研究发现，与对照组相比，观察组关节液、滑膜中miR-140-5p均呈低表达；KOAⅡ组、KOAⅢ组、KOAⅣ组相比，关节液、滑膜中miR-140-5p表达均依次降低；Spearman相关性分析显示，KOA病人关节液、滑膜中miR-140-5p的表达与K-L分级均呈负相关，提示关节液、滑膜中miR-140-5p与KOA病程发展密切相关，可能成为KOA的生物标志物、治疗新靶点，分析原因是miR-140-5p可能通过靶向调控软骨细胞外基质降解因子MMP-13、ADAMTS-5的表达［20］，参与KOA的发生、发展。MMP-13、ADAMTS-5与KOA的研究广泛。祁雷等［21］研究发现，与假手术组相比，KOA模型大鼠关节软骨组织中MMP-13、ADAMTS-5表达均呈现先升高后降低现象，与软骨退化过程密切相关。黄恺等［22］研究发现，与注射0.9%氯化钠注射液的兔骨关节炎模型相比，经黄连素治疗的模型软骨病变程度较轻，软骨组织中MMP-13、ADAMTS-5表达均较低，蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达较高。滑膜的退行性病变也是KOA的重要病理变化。羊鹏飞等［23］研究表明，非骨关节炎病人、轻度骨关节病人、中度骨关节病人相比，滑膜组织中MMP-3、半乳糖凝集素3阳性表达率依次升高，与中度骨关节炎病人相比，中度骨关节炎病人滑膜组织中半乳糖凝集素3阳性表达率较高。MMP-3、半乳糖凝集素3阳性表达率均与随病情加重而增加，在骨关节炎的发生及病情发展中发挥作用。本研究中，ROC结果显示，关节液、滑膜miR-140-5p诊断KOA的AUC 95%CI分别为0.913（0.855，0.972）、0.931（0.873，0.988），截断值分别是0.78、1.05，灵敏度、特异度、准确度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别为98.04%、78.18%、87.74%、0.76、80.65%、97.73%、4.49、0.03，96.08%、89.09%、92.45%、0.85、89.09%、96.08%、8.81、0.04，可见关节液、滑膜中miR-140-5p对KOA均有一定诊断价值，或可成为临床潜在诊断指标。

综上所述，KOA病人与非关节炎对照相比，关节液、滑膜中miR-140-5p均呈低表达，与K-L分级均呈负相关，miR-140-5p可能成为KOA的临床监测指标以及治疗靶点，具体调节机制尚需进一步研究探讨。