不同施氮量对干旱下狗牙根抗氧化酶活性及渗透调节物质含量的影响

2022-06-11孙晓梵张一龙李培英孙宗玖

草业学报 2022年6期

孙晓梵，张一龙，李培英，2，3*，孙宗玖，2，3

（1. 新疆农业大学草业与环境科学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2. 新疆草地资源与生态自治区重点实验室，新疆乌鲁木齐 830052；3. 西部干旱区草地资源与生态教育部重点实验室，新疆乌鲁木齐 830052）

干旱胁迫是限制草坪生长的最主要非生物胁迫因素［1］，且在干旱季节或地区，人草争水时，园林绿化用水首先受到限制，导致草坪出现因不能及时灌溉而枯黄甚至死亡的现象，从而影响草坪的可持续利用。对草坪草而言，干旱胁迫会降低草坪质量，影响其景观和功能发挥，甚至因极端干旱而死亡导致巨大经济损失［2］。干旱胁迫会降低植物净光合速率和气孔导度［3］，造成电子传递链的不平衡，促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，导致膜脂过氧化，使膜半渗透性功能改变、丧失［4］；同时植物也会通过积累渗透调节物质以降低细胞水势、维持细胞吸水能力［5］，缓解干旱危机。

氮素是植物生长发育过程中必需的元素之一［6］，它参与调节植物在干旱下的适应、修复能力，影响植物的抗旱性。研究发现，干旱下适度氮素营养可提高植物抗旱性。例如，干旱前施1.68 g·L−1高氮可以提高马铃薯（Solanum tuberosum）幼苗超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，抑制丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量积累［7］；225 kg·hm−2的氮素可增强玉米（Zea mays）的抗旱性［8］；Ahmadi 等［9］研究发现重度干旱胁迫时，施0.13 g·kg−1氮素（高氮）可以促进油菜（Brassica napus）游离脯氨酸（proline，Pro）含量积累，提高其抗旱性。干旱胁迫下紫苏（Perilla frutescens）幼苗脯氨酸和可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量随施氮量的增加表现出先升高后降低的趋势［10］。在草坪草上，有研究发现氮添加会导致草坪草地上生物量增加，加剧土壤水分消耗，从而导致更极端的干旱胁迫［11］。但也有研究认为适量施氮可促进草坪草抵御逆境。例如Chang 等［12］研究发现氮素可以通过促进抗氧化代谢和氮代谢来提高匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera）的耐旱性；李静静等［13］发现干旱前施15.0 mmol·L−1的NaNO3可提高草地早熟禾（Poa pratensis）叶片相对含水量和细胞抗氧化酶活性，来维持较高的草坪质量。综上所述，干旱下施氮能否促进草坪草抗旱性提高可能因草种、干旱程度、氮肥种类不同而不同。

狗牙根（Cynodon dactylon）是暖季性草坪草中抗旱性较强的物种之一，其在生长过程中对氮肥的需求量也较高。目前，外施氮素对狗牙根的研究主要集中在施用量对生长及草坪质量的影响［14］。干旱条件下氮素添加对草坪草的抗旱作用还存在一定争议，对草坪质量、生长以及干旱后恢复影响还有待探讨。因此，本研究拟开展不同施氮量对干旱胁迫下狗牙根幼苗生长及生理指标影响的研究，为生产及干旱逆境下狗牙根草坪是否能施氮以及施氮量提供技术及理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料新农1 号狗牙根（C. dactylon‘Xinnong No.1’）种子，2017年采收自新疆农业大学三坪农场。于2020年6月进行狗牙根育苗工作。将其播种在装有体积比为花土∶河沙∶草炭土=2∶2∶1 的花盆中（直径14 cm，高14 cm），每盆装土1.5 kg。土壤有机质含量为15.95%，土壤碱解氮含量为129.58 mg·kg−1，土壤速效磷含量为13.59 mg·kg−1，土壤速效钾含量为99.75 mg·kg−1。每盆种子播量为0.3 g，每3 d 灌溉1 次，待生长至苗龄45 d 时进行干旱试验处理。

1.2 试验设计

试验设5 个处理，包括：1）正常灌溉+无氮（CK）、2）干旱+无氮（D）、3）低氮+干旱（DL）、4）中氮+干旱（DM）、5）高氮+干旱（DH），每个处理8 次重复。对照、低氮、中氮、高氮处理中分别添加0、1.5、7.5 和15.0 mmol·L−1硝酸铵（NH4NO3）。干旱胁迫前，每盆分别灌溉添加相应氮浓度的蒸馏水400 mL（土壤含水量达到40%左右）；干旱试验开始后，干旱处理采用每3 d 补充50%蒸散量的方式模拟大田缓慢干旱，正常灌溉处理及复水处理每3 d 进行100%蒸散量的灌溉，每3 d 浇灌一次。在干旱至0、7、14 d、复水后7 d 进行取样，叶片鲜样用于测定叶片相对含水量（relative water content，RWC）、相对电导率（relative electric conductivity，REC），其余指标采用液氮−80 ℃速冻保存样进行测定，每个指标取3 次重复。

1.3 测定指标与方法

体积土壤含水量（volume water content，VWC）采用MP508 土壤水分传感器测定，参考黄昌勇［15］的方法，利用土壤含水量（soil water content，SWC）与VWC 的拟合方程进行SWC 的计算。草坪质量（turf quality，TQ）参照美国草坪草评价体系（national turfgrass evaluation program，NTEP）标准［16］，以草坪的密度、色泽、质地、均一性进行评分，最好质量为9 级，死亡或枯黄草坪为0 级，6 级为可接受的正常草坪。采用饱和称重法［17］测定RWC。采用电导仪法测定REC。采用上海优选生物有限公司试剂盒测定过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）含量。SOD 活性采用氮蓝四唑光化还原法、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈创木酚法、采用过氧化氢分解法测定过氧化氢酶活性（catalase，CAT）、采用硫代巴比妥酸法测定MDA 含量、采用考马斯亮蓝法［18］测定SP 含量。采用茚三酮显色法［19］测定Pro 含量。采用蒽酮比色法［20］测定可溶性糖（soluble sugar，SS）含量。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2016 进行数据预处理，采用SPSS 21.0 软件中One-way ANOVA 进行各处理间方差分析，分析方法采用Duncan 法，显著性水平判断依据为P＜0.05。采用Origin 2018 进行图的制作以及主成分分析。采用clustvis 网页进行热图聚类分析与绘图。

2 结果与分析

2.1 干旱和复水过程中土壤含水量

由图1 可知，干旱处理前（0 d），各处理间土壤含水量（SWC）维持在39.56%～40.73%，无显著差异（P＞0.05），土壤水分条件保持一致。干旱7 与14 d时干旱各处理的SWC 分别为22.57%～24.09% 和12.51%～13.09%，且高氮+干旱（DH）处理SWC 低于其他3 个干旱处理，说明DH 处理导致狗牙根更多的利用土壤水分。而复水后，各处理土壤含水量均有一定程度恢复，且DH 处理显著低于CK，但与其他3个干旱处理无显著差异（P＞0.05）。

图1 干旱及复水对土壤含水量的影响Fig. 1 Effects of drought and re-watering on soil water content不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05），大写字母CK、D、DL、DM、DH 分别表示正常灌溉+无氮、干旱+无氮、低氮+干旱、中氮+干旱、高氮+干旱，数字0、7、14、R-7 分别代表第0、7、14 天及复水7 天后的处理天数，下同。Different lowercase letters indicate significant difference between treatments （P＜0.05）. CK，D，DL，DM，DH indicate normal irrigation+No-n， drought+No-n， low-n+drought，medium-n+drought，high-n+drought respectively，the numbers 0，7，14 and R-7 represent the treatment days after day 0，7，14 and the 7th day after re-watering respectively.The same below.

2.2 不同施氮量对干旱及复水下狗牙根幼苗草坪质量及相对含水量的影响

干旱会导致TQ 降低，干旱7 d 时，土壤相对含水量为58.48%，处于中等干旱，各干旱处理TQ 与对照均无显著差异（P＞0.05）；干旱14 d，土壤处于重度干旱，4 个干旱处理的TQ 显著低于对照（P＜0.05），但DM 处理TQ 为6.25 分，显著优于D 处理；复水后DM 处理恢复较好，草坪质量表现与对照间无显著差异，为7.5分（P＞0.05，图2）。

随着干旱加剧，叶片RWC 呈下降趋势。干旱7、14 d 叶片RWC 均表现出3 个干旱施氮处理相比干旱处理显著增加（P＜0.05），且DM 处理表现最优，其与7、14 d 干旱处理相比，叶片RWC 分别增加了29.01%、60.98%。复水后，中氮处理叶片RWC 恢复至78.34%，但仍显著低于对照（P＜0.05，图2）。

图2 干旱及复水下不同施氮量对狗牙根幼苗草坪质量和叶片相对含水量的影响Fig. 2 Effects of different nitrogen rates on turf quality and leaf relative water content of bermudagrass seedlings under drought and re-watering

2.3 不同施氮量对干旱及复水下狗牙根幼苗叶片膜透性的影响

随干旱程度加深，REC 呈上升趋势。与干旱对照相比，施氮一定程度降低了干旱下叶片REC，且DM 处理表现较好，干旱7、14 d 较D 处理相比，REC 分别显著降低了48.29%和60.94%（P＜0.05）；干旱14 d 时，高氮导致叶片受害加剧，叶片REC 高于中、低氮处理，与干旱对照REC 相似。复水后中氮、高氮处理表现REC 较低，受害较轻（图3）。

图3 干旱及复水下不同施氮量对狗牙根幼苗相对电导率及丙二醛含量的影响Fig. 3 Effects of different nitrogen rates on relative electric conductivity and MDA content of bermudagrass seedlings under drought and re-watering

干旱会使狗牙根MDA 含量升高，但DM 处理在各处理时间段内均与对照无显著差异（P＞0.05），说明其受害较轻；高氮处理在干旱14 d 时表现出MDA 含量与干旱对照无显著差异（P＞0.05），说明高施氮量在重度土壤干旱时会导致狗牙根膜脂过氧化程度加剧（图3）。

2.4 不同施氮量对干旱及复水下狗牙根幼苗过氧化氢含量和抗氧化酶活性的影响

与正常灌溉相比，干旱会促进狗牙根体内H2O2积累。干旱7 d 时各干旱处理H2O2含量随施氮浓度升高而降低，且DM 和DH 处理较D 处理分别显著降低31.06%与34.92%（P＜0.05）；干旱14 d 时，D 处理H2O2含量持续上升，但DM 和DH 处理仍维持在较低水平，比D 处理低23.74%、22.57%（图4）。

图4 干旱及复水下不同施氮量对狗牙根幼苗H2O2含量及抗氧化酶活性的影响Fig. 4 Effects of different nitrogen rates on H2O2 content and antioxidant enzyme activities of bermudagrass seedlings under drought and re-watering

对于POD 活性而言，干旱0 d 时施氮处理间无显著差异但均显著高于CK 及D 处理（P＜0.05）；干旱至7 d，D、DL、DM 和DH 处理之间无显著差异（P＞0.05），但均显著高于CK 处理（P＜0.05）；干旱至14 d 时，POD 活性达到峰值，且DM 和DH 处理均显著高于D 处理（P＜0.05），分别提高163.73%和152.60%。复水后施氮处理POD 活性均显著下降（P＜0.05），恢复至对照水平，但D 处理仍保持较高值（图4）。

狗牙根叶片CAT 活性变化较为复杂。干旱0 d 时，施氮处理间无显著差异但均显著低于D 处理。干旱至7 d，DL 处理CAT 活性达到峰值，DM 和DH 处理仍低于对照；而干旱14 d 时，DM 处理较D 处理显著提高了38.46%（P＜0.05）。复水后，CAT 活性变化随施氮量增加而增加，DH 处理达最高值，较D 处理显著提高了54.16%（P＜0.05，图4）。

在干旱0 和7 d 时，狗牙根叶片SOD 活性表现出随施氮浓度升高而升高的趋势，DH 处理较D 处理分别显著提高了58.14%和55.33%（P＜0.05）；干旱14 d 时，DM 处理SOD 活性达到峰值，较D 处理显著提高了154.40%（P＜0.05），而DH 处理SOD 活性再无上升并与7 d 维持在同一水平，但仍显著高于D 处理（P＜0.05）。复水后，除DM 外，其余处理间无显著差异（P＞0.05，图4）。

2.5 不同施氮量对干旱及复水下狗牙根幼苗渗透调节物质的影响

在干旱0 d 时各处理间SP 含量无显著差异（P＞0.05），维持在24.91～26.91 mg·g−1。但干旱会促进体内SP的积累，干旱至7 d，DM 和DH 处理较D 处理分别显著提高27.72%与25.09%（P＜0.05）。干旱至14 d 时，D 和DL 处理SP 含量下降，但DM 和DH 处理仍维持在较高水平，比D 处理高61.75%、41.04%。复水后，除DM 外，其余处理间均无显著差异（P＞0.05，图5）。

在干旱0 d 时Pro 含量无显著差异（P＞0.05），维持在60.35～70.43 μg·g−1。干旱至7 d，干旱各处理Pro 含量开始小幅上升，且DM 和DH 处理均显著高于D 处理，Pro 含量提高49.66%和43.59%（P＜0.05）。干旱至14 d时，Pro 含量达到峰值，且DL、DM 和DH 处理均显著高于D 处理，分别提高79.55%、144.71%和65.14%（P＜0.05）。复水后各处理Pro 含量基本恢复到原有水平（图5）。

在干旱0 d 时SS 含量维持在14.56～19.15 mg·g−1。干旱至7 d，干旱各处理SS 含量开始小幅上升，且DH 处理显著比D 处理提高了68.47%（P＜0.05）。干旱至14 d 时，SS 含量达到峰值，且DM 处理显著高于D 处理31.53%（P＜0.05）。复水后各处理SS 含量显著下降且低于CK 处理（P＜0.05，图5）。

图5 干旱胁迫及复水下不同施氮量对狗牙根幼苗可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量的影响Fig. 5 Effects of different nitrogen rates on soluble protein，proline and soluble sugar content of bermudagrass seedlings under drought and re-watering

2.6 干旱7 和14 d 各指标热图聚类分析及主成分分析

干旱7 d 时，首先D 和DL 聚为一类，继而DM 和DH 聚为一类，再聚合CK，最终与D 和DL 聚合在一起；表现为中等干旱时DM 与DH 处理草坪性状表现接近CK 处理。干旱14 d 时，同样D 和DL 首先聚为一类，表现为二者性状最接近，然后DM 和DH 聚为一类，最终与CK 合并到一起，表现为DM 处理TQ 最接近CK 处理。层次聚类分析发现，干旱7 d 时DM 和DH 处理与D 处理相比，增加了抗氧化酶SOD、POD 活性，提高SP、SS、Pro 含量，维持了较高的叶片相对含水量及草坪质量；而干旱14 d 时DM 处理与D 处理相比，渗透调节物质SS、Pro、SP 含量及抗氧化酶CAT、SOD、POD 活性显著增加，同时维持了较低的MDA、REC、H2O2含量。此外热图聚类分析也表明中度干旱胁迫时DH 处理与CK 草坪质量较为接近，在重度干旱胁迫时DM 处理则更接近对照（图6A，C）。

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种多元统计分析，可以简化和降低高维复杂数据的维数，同时最大限度地保留原始信息。为评价两种程度干旱胁迫下氮素的作用，进行主成分分析可知，干旱7 d 时两个主成分中PC1 占比48.8%，PC2 占比39.7%，干旱14 d 时两个主成分中PC1 占比52.6%，PC2 占比36.4%。此外，还观察到PCA 与热图分析的结果表现相同，干旱7 d 时PC1 显示CK 处理与其他处理明显分开，但DH 相对更接近。而PC2 显示DH 和DM 处理与其他处理有明显的分离，但相对接近CK。干旱14 d 时，PC1 显示CK 处理与其他处理明显分开，但DM 相对更接近。另一方面，PC2 显示DM 处理与其他处理有明显的分离，但相对接近CK。主成分分析和热图层次聚类分析均表明DM 和DH 处理可以减轻不同程度干旱效应，使之更接近CK（图6B，D）。

图6 干旱下不同施氮量对狗牙根幼苗各指标热图聚类分析以及主成分分析Fig. 6 Heat map cluster analysis and principal component analysis of different nitrogen application rates on the indexes of bermudagrass seedlings under drought

3 讨论

3.1 干旱下狗牙根幼苗是否应该施氮

干旱胁迫对草坪草生长、坪用质量有很大的负面影响。通常情况下，干旱胁迫会造成TQ 和RWC 下降，REC、MDA 和H2O2含量逐渐上升。植物叶片中的RWC 随着干旱胁迫程度增加而逐渐降低，而较高的叶片RWC可以保持细胞结构［21］。本研究表明随干旱程度加剧，狗牙根叶片RWC 和TQ 随即降低，但施氮可以一定程度缓解其降低程度。中度干旱时（7 d），与D 处理相比，DM 和DH 处理可使狗牙根叶片RWC 和TQ 维持在相对较高水平；而重度干旱时（14 d），虽然DM 与DH 处理表现依然优于D 处理，但DH 较DM 处理相对较低，这可能是由于过高氮素添加导致土壤水分降低，加剧了狗牙根体内干旱程度，这与Hu 等［11］的研究结果相似。

前人研究发现，施适量氮可以缓解草坪草在干旱下受到的损伤，而过高的氮反而会造成其对干旱的敏感［22］。本研究发现，中度及重度干旱胁迫下施低氮对狗牙根幼苗抗旱性影响不大；而施中氮可以缓解中重度干旱对狗牙根幼苗造成的伤害。施高氮处理仅在良好水分条件下（0 d 和复水后）以及中度干旱下表现较高TQ，而重度干旱时表现为TQ 严重降低，这可能是由于干旱减少植物对营养的吸收，从而限制氮添加对植物代谢的影响［23］。高氮增加了土壤水分的消耗，导致后期叶片无法维持稳定的含水量，植物内环境出现紊乱，表现出损伤加剧现象。本研究还发现干旱复水后各处理组均表现向对照恢复趋势，且从TQ、RWC、REC 和MDA 指标可以看出施中氮和高氮处理恢复效果更好。但中氮水平的适宜浓度以及提高狗牙根抗旱性的作用有待在生产中验证。

3.2 不同施氮量对干旱下狗牙根幼苗膜透性及抗氧化酶的影响

细胞膜是植物抵御逆境胁迫伤害的关键组织［24］，因此REC 及MDA 可以反映植物受害情况。本研究发现随干旱程度加剧，狗牙根叶片REC 和MDA 呈持续增加趋势，当干旱至14 d 时，REC 最高的处理为D 和DH，说明干旱+不施氮和干旱+施高氮均能严重破坏细胞膜系统，导致其细胞膜透性显著增加，而中氮处理显著缓解了干旱条件下狗牙根幼苗细胞膜损伤。这与Fu 等［25］的研究结果相似，适量N 可以减少膜损伤。

面对干旱胁迫，植物进化出许多抵御胁迫的方法。植物中抗氧化酶包括SOD、POD 和CAT，在清除过量的ROS 中起着重要作用，可以保持ROS 处于动态平衡。然而，一旦植物产生的ROS 超过抗氧化酶的清除能力，抗氧化系统就会遭到破坏［26］。本研究结果表明，随干旱胁迫程度的加剧，H2O2含量会逐渐上升，无氮干旱处理在中度和重度干旱下均表现出较高的H2O2含量，而中氮和高氮处理可以显著降低不同干旱程度下H2O2含量，减轻ROS 的积累。作为ROS 清除剂，POD、SOD、CAT 活性在干旱以及氮素处理下变化较为复杂。干旱胁迫7 d，POD 活性会因干旱胁迫而显著上升，但4 个干旱处理组之间POD 活性并无显著变化；CAT 活性则表现为在低氮处理较下为活跃，而施中氮和高氮处理显著下降；SOD 活性则随氮素浓度升高表现越活跃。干旱14 d 时，D 处理SOD 部分失活，POD 和CAT 活性则表现为在D 和DL 处理下显著降低，这说明严重干旱下产生了大量的ROS 并超出了狗牙根叶片抗氧化酶的清除能力；而DM 和DH 处理下依旧保持活跃。这说明施氮可以显著提高SOD、POD 和CAT 在持续干旱胁迫下的活性。这与艾雪莹等［27］在高粱（Sorghum bicolor）上的研究结果相似，在干旱胁迫下施氮较不施氮处理可以提高植物的抗氧化酶（SOD、POD）活性和降低MDA 和H2O2含量；也进一步说明植物抗氧化能力在很大程度上取决于氮的有效性，较高的氮可通过增强植物的抗氧化能力和抑制脂质过氧化来提高植物的抗逆性［25］，因而适量氮肥可以提高干旱条件下植物保护酶活性、降低MDA 含量。

3.3 不同施氮量对干旱下狗牙根幼苗渗透调节物质的影响

植物体内的渗透调节物质可以间接体现出植物对环境的适应能力。Pro 在植物组织中的含量通常较低，在干旱胁迫下会不断积累，其含量越高，证明其抗旱能力越强［28］。但在另外一些研究中，Pro 的积累是植物损伤的体现，而不是压力耐受性的指标［29］。胁迫下Pro 含量的增加可能是蛋白质分解的结果，也可能是由于植物生长的减少导致脯氨酸使用的减少；而Pro 的积累可以降低细胞内的渗透势和水势，为细胞提供继续吸收水分的机会。

本研究发现，干旱下各处理不论是否施氮，其渗透调节物质变化规律是一致的。SP 含量在7 d 达到峰值，SS、Pro 含量在第14 天仍有上升趋势，但在中度干旱时，DM 和DH 处理就能维持较高的SP、Pro 含量，且DH 还能维持较高的SS 含量。而重度干旱下，DM 与D 相比，其SP、Pro 和SS 含量均能保持在更高水平，说明狗牙根在水分亏缺时，施氮可促进其体内细胞合成小分子蛋白质等渗透调节物质来增大细胞渗透势，缓解干旱对狗牙根幼苗细胞膜造成的伤害。赵永平等［10］在紫苏幼苗抗旱研究中发现，渗透调节物质含量并不会随干旱程度加剧一直升高，而本研究中仅D、DL 和DH 处理组表现出SP 含量呈先升高后降低趋势，在中度干旱下就达到峰值，而Pro 和SS 含量则表现为随干旱程度加剧逐渐上升，复水后再下降的趋势。可能因为新农1 号狗牙根是较为耐旱的草种，在干旱14 d 时依旧能维持逆境下的应激反应，且施适宜的氮素可以使狗牙根在干旱逆境中维持较高的渗透调节功能。