2-十三烷酮胁迫下棉铃虫FoxAl调控CYP6B6的表达

魏倩 刘小宁 赵洁

（1. 新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2. 石河子大学农学院，石河子 832003）

叉头框蛋白（forkhead box protein，Fox）家族是一类含有保守的fork head（FH）结构域的转录因子，该结构域中的“螺旋-转角-螺旋”基序与下游基因启动子区的顺式作用元件结合［1-2］。Fox转录因子的分布十分广泛，从酵母、线虫、昆虫、海鞘、爪蟾、小鼠到人类中，已经发现了数百种Fox蛋白［3-5］。根据Fox蛋白在N端和C端的变异程度，将Fox家族分为24个亚家族和1个孤儿类别［6］。已发表的昆虫基因组或转录组结果表明，昆虫体内并不包含所有的Fox亚家族，例如家蚕体内主要缺失FoxAB、FoxE、FoxH、FoxI、FoxK、FoxL1、FoxM、FoxQ1、FoxR和FoxS［7］。目前，昆虫Fox蛋白的研究主要集中于FoxO和FoxA亚家族，它们在昆虫的氧化应激、生长发育、细胞凋亡、解毒代谢、糖脂代谢和先天免疫等方面发挥着重要的作用［8-12］。

棉铃虫（Helicoverpa armigera）幼虫是一种多食性的农业重要防治害虫。目前，关于棉铃虫Fox蛋白的研究报道极少。Bao等［13］从棉铃虫的蛹内克隆获得第一个Fox基因，即HaFoxA，并发现FoxA蛋白可以与滞育激素和信息素生物合成激活神经肽（diapause hormone-pheromone biosynthesis-activating neuropeptide，DH-PBAN）基因的启动子结合，从而参与蛹的激素合成并影响滞育过程。Cai等［14］首次克隆获得棉铃虫的FoxO基因，并发现在20-羟基蜕皮激素的影响下，FoxO蛋白与Broad转录因子亚型7（broad isoform 7，BrZ7）基因的启动子结合，提高BrZ7以及下游羧肽酶A（carboxypeptidase A，CPA）基因的表达量，从而在棉铃虫的蜕皮过程中促进蛋白质水解。Li等［15］将棉铃虫3龄幼虫体内的FoxA进行RNA干扰（RNA interference，RNAi）后发现，响应苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis的两个Cry毒素蛋白受体，即ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter proteins，ABCC2和ABCC3）基因的表达都显著降低，并且幼虫对Cry毒素的耐受性明显增强。

2-十三烷酮（2-tridecanone，2-TD）是一种天然存在于茄科植物中的重要次生物质，它能够诱导昆虫体内细胞色素P450解毒酶（cytochrome P450 enzymes）基因的过量表达，例如低浓度的2-TD能显著提高棉铃虫CYP3、CYP6亚家族基因的表达，激活棉铃虫的解毒代谢通路［16-17］。CYP6B6是棉铃虫中肠内一个重要的解毒酶基因，它在棉铃虫的有毒物质代谢和生长发育过程中都发挥重要作用［18］。然而，2-TD长期胁迫却会降低CYP6B6表达量，导致棉铃虫化蛹时间延长、并显著降低化蛹率和羽化率［19-20］。同时，在低浓度2-TD短期胁迫后，对CYP6B6基因的启动子进行分析发现，-373/+21 bp处（即HE1片段）是最重要的活性序列［21］。本课题组前期利用酵母单杂交技术，筛选2-TD短期胁迫后能与HE1片段结合的调控因子，发现一个阳性酵母的测序片段中含有FH结构域的部分序列；同时在2-TD短期处理6龄幼虫的中肠转录组中发现一个新的Fox基因，它和CYP6B6一样都能响应低浓度2-TD胁迫。将克隆得到的新Fox基因与已发表的昆虫FoxA进行多序列比对后发现，该基因包含Fox家族保守的FH结构域，以及一个疑似FoxA亚家族转录激活结构域（Domain Ⅱ）的相关区域，并把该基因命名为FoxA类似基因（forkhead box protein A-like，FoxAl）［22］。随后，对CYP6B6启动子进行转录因子结合位点预测，发现HE1片段上含有多个Fox转录因子的结合位点。基于以上的研究基础，我们推测FoxAl有可能是CYP6B6的转录因子，从而参与棉铃虫的解毒代谢和生长发育过程。

因此，本研究先利用酵母自激活试验，验证FoxAl蛋白是否具有转录激活功能；随后通过凝胶阻滞试验，验证FoxAl蛋白能否与CYP6B6启动子HE1片段结合。在确定FoxAl是CYP6B6的转录因子后，一方面用不同浓度的2-TD胁迫处理棉铃虫6龄幼虫，另一方面注射FoxAl dsRNA于棉铃虫5龄幼虫体内，通过实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）技术测定不同时间后幼虫中肠内FoxAl和CYP6B6的表达情况，确定FoxAl与CYP6B6启动子的调控关系，为FoxAl蛋白参与棉铃虫的生长发育和解毒代谢过程提供依据，为进一步探索棉铃虫对次生物质的适应机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫：棉铃虫采集于乌鲁木齐市安宁渠镇，并在本实验室用人工饲料长期饲养，试虫种群为第5代。人工饲料配方：玉米粉120 g，大豆粉40 g，琼脂20 g，山梨酸1 g，酵母粉12 g，青霉素0.1 g，抗坏血酸2 g，维生素C 4 g，肌醇0.2 g，复合维生素B 0.9 g，蒸馏水620 mL。饲养条件：温度（26±1）℃，相对湿度（75±5）%，光周期16L∶8D。

菌株和质粒：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y2HGold菌株购自Clontech公司，最适生长温度30℃；大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，最适生长温度37℃；大肠杆菌Transetta（pET32a-FoxAl）菌株由课题组前期构建，最适生长温度37℃，蛋白表达最适温度25℃。pMD18-T-FoxAl质粒由课题组前期构建，pGBKT7质粒购自Clontech公司。

试 剂：DIG-High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit II购自Roche公司；Matchmaker Insert Check PCR Mix 2、2×YPDA Broth、SD/-Trp with Agar和X-α-Gal均购自Clontech公司；EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5×）、EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（无色，10×）和EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（蓝色，10×）均购自上海碧云天生物技术；2-十三烷酮购自上海麦克林生化科技有限公司；DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、BamH I、EcoR I和T4 DNA Ligase均购自宝生物工程（大连）有限公 司；Proteinlso Ni-NTA Resin、EasyPure RNA Kit、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix和PerfectStart Green qPCR SurperMix（+Dye I）均购自北京全式金生物技术有限公司；T7 RiboMAX Express RNAi System购自北京普洛麦格生物技术有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 FoxAl蛋白的转录激活活性测定 以前期测序正确的pMD18-T-FoxAl质粒为模板，PCR扩增获得FoxAl的开放阅读框（ORF）序列，其中上、下游引物分别为（5'-GGAATTCATGGCGGCTAGAACA GGT-3'，EcoR I酶切位点）和（5'-CGGGATCCCTAGT CCACCGTGATGA-3'，BamH I酶切位点）。随后，用限制性内切酶EcoR I和BamH I将FoxAl的ORF和pGBKT7质粒分别进行双酶切，酶切产物经T4 DNA Ligase过夜连接后，转化大肠杆菌DH5α，再通过菌液PCR和酶切鉴定获得重组后的pGBKT7-FoxAl质粒。按照Y2HGold菌株使用说明，将pGBKT7-FoxAl质粒转入酵母Y2HGold菌株内，并在SD/-Trp固体培养基上30℃倒置培养3-4 d，挑取生长良好、直径约2-3 mm的酵母菌落进行PCR鉴定。取适量鉴定正确的Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）重组菌株，以1∶100的比例稀释于0.9% NaCl溶液中，取100 μL重悬菌液分别涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-Gal固体培养基上，30℃倒置培养2-3 d，观察菌落生长状况和显色情况。阴性对照为Y2HGold和Y2HGold（pGBKT7）菌株按同等比例稀释后，生长于SD/-Trp/X-α-Gal固体培养基上。

1.2.2 FoxAl蛋白和CYP6B6启动子的结合反应 按照赵洁等［22］的文献，经表达、纯化和超滤获得融合蛋白His-FoxAl。按照DIG-High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit II的说明书制备CYP6B6启动子HE1片段的核酸探针，并检测探针的标记效率。按照EMSA/Gel-Shift结合缓冲液的步骤进行HE1探针（1 ng）和FoxAl蛋白（1 μg或1.5 μg）的结合反应，参考Michael R. Green的《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》第二章方案3制备5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，并进行DNA-蛋白质复合物的核酸电泳。利用浸没式转印电泳仪将HE1探针转移至带有正电荷的尼龙膜上，并进行紫外线交联固定。按 照DIG-High Primer DNA Labeling and Detection Starter kit II的步骤进行HE1探针的免疫印迹和化学发光成像。此外，为了避免假阳性的阻滞结果，进行未标记探针和无关基因片段的冷竞争反应，分别在结合反应体系中再加入标记探针100倍量的未标记HE1片段或棉铃虫肽聚糖识别蛋白（Peptidoglycan recognition proteins，PGRP-B）基因片段。

1.2.3 FoxAl-dsRNA处理棉铃虫5龄幼虫 以棉铃虫FoxAl的ORF为模板，经PCR扩增和产物回收获得含有T7启动子的目的片段，按照T7 RiboMAX Express RNAi System试剂盒的操作步骤合成和纯化获得FoxAl的dsRNA。取当天蜕皮的5龄幼虫饥饿2 h后冰上麻醉20 min，在幼虫腹部第6节和第7节的节间膜处，用微量注射器将FoxAl 的dsRNA注入幼虫体腔内，dsRNA为5 μg/头，对照组注射等量的Nuclease-free water。注射结束后，将棉铃虫幼虫置于35 mm的培养皿内，在幼虫恢复正常活动后放置于含有人工饲料的玻璃管内，使其在正常环境条件下生长。

1.2.4 2-TD胁迫处理棉铃虫6龄幼虫 将所需2-TD溶于60℃预热的10%乙醇溶液中，充分融化后添加于等质量的棉铃虫人工饲料中，分别配制成不同剂量（0，5，10和20 mg/g）的处理饲料。取当天蜕皮的6龄幼虫饥饿2 h后，放置于含有不同2-TD剂量饲料的玻璃管内，使其在正常环境条件下生长。

1.2.5 qPCR检测FoxAl和CYP6B6的表达谱 在dsRNA注射后的不同时间（24，48，72和 96 h）和2-TD处理后的不同时间（6，12，20，30和48 h），取3头仍然存活的幼虫的中肠组织作为一个生物学样本，按照EasyPure RNA Kit和EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix的操作步骤提取中肠的总RNA，并反转录为相对应的cDNA，每个处理包含3个生物学样本。按照PerfectStart Green qPCR SurperMix（+Dye I）的说明书，以棉铃虫Tubulin作为内参基因，经qPCR技术分别检测FoxAl和CYP6B6的相对表达情况，每个生物学样本包含3个技术重复。qPCR反应体系为10.0 μL的2×SYBR Green PCR master mix、8.0 μL的RNase-free H2O、0.5 μL的上游引物、0.5 μL的下游引物、1.0 μL的cDNA。反应 程 序：94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30s，40个循环。FoxAl引物F：5'-TGATGCCGTTGAGAAGACTA-3'；R：5'-CACTTTCCCTGACCACTTG-3'。Tubulin引 物F：5'-TCCAACTCACACACTCGCT-3'；R：5'-GGAAGCAGATGTCGTATAATG-3'。CYP6B6引物F：5'-TTCAAACTTATACCATGTCCACAA-3'；R：5'-CCAATTGACGGAGCTCTAGAATCA-3'。

1.2.6 数据分析 在每个处理时间点，RNAi试验中以Nuclease-free water组为对照，2-TD胁迫试验中以0 mg/g组为对照，用2-ΔΔCt法计算FoxAl和CYP6B6的相对表达量。运用Prism 8.0软件进行统计分析：RNAi试验，在每个时间点进行t检验（Student’s t test）；2-TD胁迫试验，在每个时间点和每个浓度下都进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和多重比较（Tukey法）。运用SPSS 20.0软件，将2-TD胁迫试验中FoxAl和CYP6B6的相对表达量，按照不同胁迫浓度和不同胁迫时间进行相关性分析。

2 结果

2.1 棉铃虫FoxAl的转录激活功能验证

将棉铃虫FoxAl的ORF连接至酵母表达载体pGBKT7质粒，构建的重组质粒pGBKT7-FoxAl经EcoR I和BamH I酶切，图1-A电泳结果显示酶切片段小于1 000 bp、大于500 bp，其位置与FoxAl ORF（669 bp）的大小一致，表明重组质粒pGBKT7-FoxAl构建成功。将重组质粒转入酵母Y2HGold菌株感受态后，进行酵母菌落PCR，图1-B结果显示扩增条带略小于750 bp，其位置与FoxAl ORF的大小一致，表明酵母菌株Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）构建成功。随后，将构建好的Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）菌液涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-ga1培养基上，通过颜色变化检测FoxAl蛋白对酵母MEL1报告基因是否有激活作用。图1-C结果显示，将两个对照Y2HGold和Y2HGold（pGBKT7）的菌液直接涂布于SD/-Trp/X-α-ga1培养基上，前者不能生长、后者正常生长但无颜色变化，对照组的结果符合预期，表明整个转化过程正常且无污染；将Y2HGold（pGBKT7-HaFoxAl）菌液涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-ga1培养基上，酵母菌落正常生长且大小合适，表明插入基因能正常表达，同时该菌液在X-αga1诱导下呈现蓝色，表明FoxAl蛋白本身含有转录激活结构域，能激活酵母体内下游基因的正常表达。

图1 酵母Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）菌株的转录激活功能检测Fig.1 Transcriptional activation test of transformed yeast Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）strain

2.2 棉铃虫FoxAl与CYP6B6启动子HE1片段结合

首先，用地高辛标记的HE1探针与有活性的His-FoxAl蛋白进行凝胶迁移率检测，图2-A的结果显示，1 μg和1.5 μg的His-FoxAl蛋白都能与1 ng HE1探针结合并形成阻滞条带。随后，通过无关基因片段和未标记探针的冷竞争反应，进一步验证1 ng HE1探针与1 μg His-FoxAl蛋白结合形成阻滞条带的真实性。图2-B的结果显示，泳道3在反应体系中再加入标记探针100倍量的棉铃虫PGRP-B片段时，HE1探针与FoxAl蛋白形成的阻滞条带仍然存在；而泳道4中再加入100倍量的未标记HE1片段时，原有的HE1-FoxAl阻滞条带消失不见；这两个竞争反应结果表明，FoxAl蛋白与CYP6B6启动子HE1片段的结合是特异性的，是通过FoxAl蛋白的识别螺旋与HE1片段的特定碱基以氢键形式结合。

图2 棉铃虫FoxAl蛋白与CYP6B6启动子HE1片段的结合验证Fig. 2 Verification of FoxAl in H. armigera binding to the HE1 fragment of CYP6B6 promotor

2.3 棉铃虫FoxAl沉默对CYP6B6表达水平的影响

将5 μg的FoxAl dsRNA注射到棉铃虫5龄幼虫体内，在注射后的24、48、72和96 h，检测中肠内FoxAl和CYP6B6的表达量变化情况。图3-A的FoxAl相对表达量结果显示：与对照组相比，注射FoxAl dsRNA后中肠内的FoxAl表达量从48 h开始显著降低（P=0.001 8），并在96 h降至最小值（P=0.000 6）；图3-B的CYP6B6相对表达量结果显示：与对照相比，FoxAl dsRNA处理后CYP6B6的表达从24 h开始显著降低（P=0.001 9），在48 h降至最小值（P＜0.000 1），并在96 h内一直被显著降低（P=0.008 2）。

图3 FoxAl dsRNA 注射后棉铃虫5龄幼虫中肠内FoxAl和CYP6B6的相对表达量Fig. 3 Relative expression of FoxAl and CYP6B6 in the midgut of 5th instar larvae after FoxAl dsRNA injected

2.4 2-TD处理对棉铃虫中肠FoxAl和CYP6B6表达水平的影响

用3种浓度的2-十三烷酮（2-TD）处理棉铃虫六龄幼虫，检测中肠内FoxAl和CYP6B6的表达量变化情况。图4-A的FoxAl相对表达量结果显示：在5 mg/g的2-TD处理组内（F=5.180，P=0.001 9），12 h的表达量最高、30 h的表达量最低，且30 h时显著低于空白组（P=0.003 5）；在10 mg/g的2-TD浓度下（F=12.86，P＜0.000 1），12 h的表达量最高、48 h的表达量最低，6 h时极明显高于对照（P＜0.000 1）， 20，30和48 h时 显 著 低 于 对 照（P=0.027 5，P=0.001 4，P=0.042 7）；在20 mg/g处理中（F=11.27，P＜0.000 1），12 h的表达量最高、48 h的表达量最低，12 h时显著高于空白对照（P=0.013 1）、而20和48 h时明显低于空白对照（P=0.006 3，P=0.027 3）。在3个2-TD浓度处理组内，棉铃虫FoxAl表达量随时间变化基本一致，都是短时间内表达量上升、至12 h达到最高值，然后在20 h表达量快速下降。

CYP6B6的相对表达量结果显示：在5 mg/g的2-TD处理后（F=5.016，P=0.002 3），20 h的表达量最高、30 h的表达量最低，且20 h时明显高于对照（P=0.023 6）；在10 mg/g 2-TD处理组（F=33.63，P＜0.000 1），12 h的表达量最高、48 h的表达量最低，12 h时显著高于对照（P=0.037 3），30和48 h时显著低于对照（P=0.043 1，P=0.023 4）；在20 mg/g的处理中（F=12.95，P＜0.000 1），12 h的表达量最高、48 h的表达量最低，12 h时极显著高于空白对照（P=0.000 8）。在3个2-TD浓度处理后，CYP6B6表达量随时间变化基本相似，都是在12 h内急剧升高、在20 h内基本维持高水平表达，然后在30 h迅速下降（图4-B）。

图4 2-TD胁迫后棉铃虫6龄幼虫中肠内FoxAl和CYP6B6的相对表达量Fig. 4 Relative expression of FoxAl and CYP6B6 in the midgut of the 6th instar larvae after 2-TD treated

将不同2-TD浓度处理后的FoxAl和CYP6B6的相对表达量进行相关性分析。表1结果显示，3个胁迫浓度下FoxAl和CYP6B6的表达量都是正相关的，两者的相关系数随着2-TD浓度增加逐渐增大，并且在20 mg/g浓度处理时两者呈显著地高度正相关（r=0.819，P=0.045）；除了20 h以外，其他胁迫时间点下FoxAl和CYP6B6的表达量都是正相关的，12 h、30 h和48 h时两者的表达量是高度正相关（r=0.987，r=0.863，r=0.978），其中12 h和48 h时都是显著相关（P=0.007，P=0.011）。

表1 FoxAl和CYP6B6表达量的相关性分析Table 1 Correlation analysis of FoxAl and CYP6B6 expression

3 讨论

课题组前期分析棉铃虫FoxAl蛋白的氨基酸序列时，发现该蛋白只含有一个完整的FH结构域，不包括FoxA亚家族的两个转录激活域［22］。为了明确FoxAl蛋白是否具有转录激活活性，本研究通过酵母自激活试验证明了该蛋白能够激活MEL1报告基因的转录，从而使酵母菌株在缺陷培养基上正常生长并显蓝色。作为棉铃虫体内一个新的Fox家族基因，FoxAl的具体功能与蛋白结构密切相关，因此后期还将进一步明确FoxAl蛋白中主要的转录激活区域以及相关位点。

已有研究表明，在外界物质的刺激下，昆虫Fox蛋白的表达量会迅速上升并进入细胞核内，调控下游基因的转录［14］。例如用一种大环内酯类免疫抑制剂—雷帕霉素饲喂果蝇Drosophila成虫，其肠道内FoxA的表达量升高并大量入核，FoxA激活Diptericin和Metchnikowin基因的转录，表达两种肠道抗菌肽，从而参与果蝇免疫系统［10］。本研究在植物次生物质的胁迫下，棉铃虫体内FoxAl的表达量变化情况。结果显示3种低浓度（5，10和20 mg/g）的2-TD胁迫6龄幼虫后，中肠内FoxAl的表达量在12 h内迅速升高，并在20 h迅速降低，随着胁迫时间的延长，该基因mRNA含量基本维持稳定。目前棉铃虫FoxAl的抗体正在制备中，后期将从蛋白质水平进一步证实FoxAl的表达情况。

细胞色素P450是昆虫体内一种重要的解毒酶系。大量研究表明，P450基因过量表达是昆虫产生抗药性的机制之一，其中CYP6亚家族与植物次生物质和杀虫剂的耐受性密切相关［23-24］。例如2-TD能诱导棉铃虫体内CYP6B7基因的过量表达，并使棉铃虫对拟除虫菊酯产生抗性［25-26］。根据已发表的文章，多次证实低浓度（＜50 mg/g）的2-TD短期胁迫棉铃虫幼虫后，中肠组织内CYP6B6的蛋白含量能迅速增加，并参与解毒代谢过程［19-21］。本研究利用低浓度的2-TD处理棉铃虫6龄幼虫不同时间后，检测中肠内CYP6B6的表达量，本试验结果与前人的研究结果相似，3个2-TD浓度都能快速提高CYP6B6的mRNA含量，而随着胁迫时间延长，CYP6B6的表达量都会逐渐降低。在处理30 h-48 h的时间段内，与空白对照组相比，5和10 mg/g处理组的幼虫取食量减少，而20 mg/g处理组的幼虫大量提前预蛹，其中部分幼虫的中肠组织缩短、颜色加深，甚至呈现粉红色。这些现象表明，即使是低浓度的2-TD，长时间胁迫也会降低幼虫的解毒能力，甚至影响棉铃虫的生长发育。

在预蛹的果蝇转化品系P［hs-Fkh111］中，37℃热处理增加唾腺中FoxA的含量后，发现下游P450基因的表达发生改变，其中CYP9B2，CYP6A20和CYP28D1的表达量分别提高3.88，24.39和100.87倍，而CYP4E2和CYP6V1的表达量变化倍数都为-2.15［27］。同时在前期进行CYP6B6启动子分析时，预测出大量的Fox蛋白结合位点。因此，我们推测新的棉铃虫FoxAl蛋白也许能与CYP6B6启动子结合，从而响应植物次生物质胁迫。本研究通过凝胶阻滞试验证实了该假设，棉铃虫FoxAl蛋白能与CYP6B6启动子的核心序列HE1片段结合。通过多种软件的进一步筛选，HE1片段中可能与FoxAl蛋白结合的位点有3个，后期将通过截断HE1片段，进一步缩小FoxAl蛋白的结合范围，同时合成相应的突变探针，明确FoxAl蛋白的具体结合位点。

本研究通过腹腔注射法沉默幼虫中肠内FoxAl的表达后，CYP6B6的表达量也发生显著降低，这说明FoxAl蛋白对CYP6B6的转录调控是正向的。此外，2-TD胁迫后FoxAl和CYP6B6的表达量变化趋势基本相似，对两者的表达量进行相关性分析，结果显示二者总体是正相关的，甚至在20 mg/g处理浓度、以及12，30和48 h处理时间都是高度正相关，该结果表明FoxAl可能是CYP6B6的转录激活因子，正向调控CYP6B6的表达。值得注意的是，在处理20 h后FoxAl的表达量显著降低，而CYP6B6依然高水平地表达，两者的表达量呈低度负相关。转录因子FoxAl表达量出现拐点的时间（12 h）早于下游基因CYP6B6出现的时间（20 h），在此时间段内可能还有其它转录激活因子或辅因子，使CYP6B6持续过量表达。同时，因为检测点相隔时间较长，后期将进一步缩短间隔时间，细化FoxAl和CYP6B6的表达量变化情况。

4 结论

棉铃虫FoxAl蛋白能与CYP6B6启动子结合，并且在有毒物质胁迫下，FoxAl蛋白可能是CYP6B6的转录激活因子。