非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维值和复合菌剂添加水平对构树型发酵全混合日粮发酵品质和霉菌毒素含量的影响

2022-06-10陈光吉熊先勤何润霞邹晓敏尚以顺李小冬李世歌

动物营养学报 2022年5期

陈光吉熊先勤何润霞田雄邹晓敏杨洪张坤尚以顺李小冬,3 李世歌,3 张蓉

(1.贵州省农业科学院草业研究所，贵阳550006；2.贵州阳光草业科技有限责任公司，独山558200；3.贵州鼎芯农牧科技有限公司，贵阳550008；4.道真仡佬族苗族自治县畜牧渔业发展服务中心，道真563500； 5.务川仡佬族苗族自治县畜牧水产服务中心，务川564399)

当前，蛋白质源饲料匮乏仍然是制约我国畜牧和饲料行业高质量发展的短板，加大农产品加工副产物、饲用植物、糟渣类等非常规蛋白质饲料资源的开发力度是有效应对策略之一[1]。构树(Broussonetiapapyrifera)，又名楮树、楮桃子、鹿仔树等，多年生落叶乔木，为桑科(Moraceae)构树属(Broussonetia)落叶乔木植物，是我国应用历史悠久的多功能乡土树种，广泛应用于造纸、饲料、医药等行业[2]。诸多研究表明，构树叶中粗蛋白质(CP)含量达20%左右，综合比较氨基酸、维生素和矿物质等养分种类和含量，构树叶的营养价值介于玉米与大豆之间，是一种优质的蛋白质源粗饲料，在适宜种植区具有良好开发前景[3]。通常，构树适时刈割后的加工和利用方法包括切碎直接青饲、干燥制粉、简单青贮和生物发酵等，其中生物发酵方法由于具有改善适口性、降解纤维含量、提高养分消化率等作用，成为当前研究聚焦点之一。目前发酵构树饲料已广泛应用于仔猪[4]、育肥猪[5]、奶牛[6]、肉牛[7]和肉鸡[8]等饲粮中并取得了良好效果，然而多数报道集中在构树发酵饲料成品的应用研究上，还缺乏对生产端饲料合理配制的系统研究。

发酵饲料品质主要由发酵工艺(混合均匀度、压实度、密封性等)、原料组成结构、发酵菌种类型和添加水平等综合因素决定。此外，报道指出反刍动物饲粮中的中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)与非纤维性碳水化合物(non-fiber carbohydrates,NFC)分别作为瘤胃慢速和快速降解的碳水化合物组分，两者相对含量会通过调控反刍次数、瘤胃发酵特性和填充度，以及消化道内激素的分泌释放，进而影响采食量和生产性能的特征指标[9-10]。已有研究者将NFC/NDF值值作为评价饲粮配方结构合理性的表征指标[11-12]，因此发酵全混合日粮(fermentation total mixed ration，FTMR)在配方上考虑NFC/NDF值具有现实意义。

在发酵饲料生产中添加适宜的菌种是提高发酵速率、减少营养损失、减少物料抗营养因子的重要措施。常见的菌种包括乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等，其中乳酸菌由于有机酸产生速率高，抑制霉菌效果显著而被广泛应用，而酵母菌作为单细胞真菌本身含有丰富的养分，且对动物肠道屏障和免疫有良好的调控作用，枯草芽孢杆菌则会通过快速消耗氧气为物料创造厌氧发酵环境，同时产生抗菌肽等具有抗病、促生长等作用的代谢产物，因此要根据各菌种特性进行选择和组合[13]。目前，酵母菌和乳酸菌的组合协同发酵在发酵饲料领域已得到研究和应用，可用于发酵饲料基础模式的构建[14]。因此，本试验以NFC/NDF值和复合菌剂添加水平为试验因子，探究构树型FTMR发酵品质和霉菌毒素含量的变化规律，旨在为构树发酵饲料产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

2020年7月在贵州省遵义市务川仡佬族苗族自治县构树产业孵化园区进行构树型FTMR的现场试验，在贵州省农业科学院草业研究所进行样品的实验室测定。

1.2 试验材料

本研究所述的构树型FTMR是将全株构树和青贮玉米切碎至5～8 cm后与精饲料、复合菌剂按照一定比例充分混合、压实、密封、厌氧发酵后的可饲物。其中，全株构树是指将离地高度为1.2 m的杂交构树连同植株的茎和叶进行刈割后的木本青绿饲料。试验所用复合菌剂活菌数保证值为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)≥2.00×107CFU/g、酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)≥2.00×107CFU/g，水分含量≤10%。

1.3 试验设计

试验采用双因子交叉分组试验设计，2个因子分别为饲粮NFC/NDF值(分别为1.08、1.34、1.60、1.86)和复合菌剂添加水平(分别为0、2、4、8 g/kg DM)，试验设计详见表1。在基础配方上，除纤维结构和有效能值外，其他养分基本保持一致，各NFC/NDF值梯度的饲粮组成及营养水平见表2。为保证FTMR的NFC/NDF值符合试验设计的预设梯度，在配制前测定所有原料的概略养分。

表1 试验设计

表2 饲粮组成及营养水平(干物质基础)

续表2项目 Items NFC/NDF值 NFC/NDF value1.081.341.601.86非纤维性碳水化合物 NFC39.8044.1347.6950.54钙Ca 2.022.082.051.94磷P 0.470.510.550.59增重净能 NEg/(MJ/kg)4.945.375.726.03

1.4 FTMR的制备

将复合菌剂按试验设计分别加入到各组饲粮的精料中预混匀，分装备用；然后按照试验设计将粉碎至3～5 cm的足量全株构树和青贮玉米与上述精料一并添加到全混合日粮搅拌机(山东鲁工装备制造有限公司)中混匀。用“四分法”取混匀的全混合日粮，装入真空袋(净重1.5 kg)，抽出空气随即密封编号，存放于室内干燥处室温发酵。每组设4个重复。

1.5 样品采集与指标测定

在发酵第30天打开真空袋，按照4分法取200 g样品放入榨汁机中，加入1 800 mL蒸馏水搅拌捣碎后用4层纱布和定性滤纸过滤得浸出液，所得浸出液一部分立即测定pH，另一部分-20 ℃保存，用于有机酸含量的测定[15]；另取500 g样品直接保存于-20 ℃，待测霉菌毒素含量。

FTMR原料概略养分分析：原料的干物质(DM)、CP、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)、NDF、酸性洗涤纤维(ADF)、钙(Ca)和磷(P)含量参照张丽英[16]的方法进行测定。

有机酸含量测定：乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量采用岛津LC-20A型高效液相色谱仪测定，色谱柱为InertSustain C18(5 μm×4.6 mm×250 mm)；流动相由pH 2.8的0.05 mol/L H3PO4-KH2PO4缓冲溶液与乙腈以体积比95∶5组成，流速为0.5 mL/min，柱温为16 ℃，紫外检测器的波长为210 nm，进样体积10 μL。

霉菌毒素含量测定：用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂测定黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEA)含量，试剂盒购自上海快灵生物科技有限公司，具体步骤参考张志国等[17]的报道。

1.6 数据统计与分析

试验数据用Excel 2010进行整理后，首先调用SPSS 18.0软件的“一般线性模型(GLM)”程序进行方差分析，主效应分别为NFC/NDF值和复合菌剂添加水平以及两者间的互作。然后用Duncan氏法对各组的最小二乘均值进行多重比较，P<0.05表示差异显著。最后调用“简单相关分析(SCA)”程序对有机酸和霉菌毒素含量相关性进行分析。结果用平均值表示，各组数据的变异程度用均值标准误(SEM)表示。

2 结果与分析

2.1 FTMR的pH和有机酸含量

由表3可知，NFC/NDF值显著影响了发酵底物的pH与乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量(P<0.05)。其中，pH随NFC/NDF值的提高呈显著的线性和二次变化(P<0.05)，各组间均存在显著差异(P<0.05)，在NFC/NDF值=1.08时最高，NFC/NDF值=1.60时最低；乳酸和丙酸含量随NFC/NDF值的提高呈显著的线性和二次变化(P<0.05)，乙酸和丁酸含量随NFC/NDF值的提高呈显著的二次变化(P<0.05)，各组间乳酸、乙酸和丙酸含量均存在显著差异(P<0.05)，NFC/NDF值=1.60时乳酸、乙酸和丙酸含量最高，而NFC/NDF值=1.60时丁酸含量最低。

表3 FTMR的pH和有机酸含量

复合菌剂添加水平显著影响了发酵底物的pH与乳酸、丙酸和丁酸含量(P<0.05)，但对乙酸含量无显著影响(P=0.271)。其中，pH以未添加组最高，显著高于3个复合菌剂添加组(P<0.05)；3个复合菌剂添加组的乳酸含量较高，显著高于未添加组(P<0.05)；4 和8 g/kg DM复合菌剂添加组的丙酸含量较高，显著高于未添加组和2 g/kg DM复合菌剂添加组(P<0.05)，而丁酸含量则相反。

此外，NFC/NDF值与复合菌剂添加水平对发酵底物的pH和有机酸含量有显著的互作效应(P<0.05)。其中，pH以A1组最高，C1组最低；乳酸含量以C3和C4组较高，A1组最低；乙酸含量以C2和C3组较高，A3组最低；丙酸含量以C3组最高，A1组最低；丁酸含量以A1和A2组较高，C2组最低。

2.2 FTMR的霉菌毒素含量

由表4可知，NFC/NDF值显著影响了发酵底物的黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量(P<0.05)。NFC/NDF值=1.08时，3种霉菌毒素含量均为最高，显著高于与其他NFC/NDF值组(P<0.05)。黄曲霉毒素B1含量随NFC/NDF值的提高呈显著的线性和二次变化(P<0.05)，以NFC/NDF值=1.60时最低；呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量随NFC/NDF值的提高均呈显著的二次变化(P<0.05)。

表4 FTMR的霉菌毒素含量

复合菌剂添加水平显著影响了黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量(P<0.05)，对呕吐毒素含量无显著影响(P>0.05)。其中，黄曲霉毒素B1含量以未添加组最高，显著高于3个复合菌剂添加组(P<0.05)；4和8 g/kg DM复合菌剂添加组的玉米赤霉烯酮含量较低，显著低于未添加组和2 g/kg DM复合菌剂添加组(P<0.05)。

此外，NFC/NDF值与复合菌剂添加水平对发酵底物的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量有显著的互作效应(P<0.05)。其中，黄曲霉毒素B1含量以A1组最高，D4、B4和B2组较低；类似地，A1组玉米赤霉烯酮含量最高，B4和B2组较低(P<0.05)。

2.3 FTMR的pH及有机酸含量与霉菌毒素含量的相关性

由表5可知，发酵底物的pH与3种霉菌毒素含量呈极显著的正相关关系(P<0.01)，而与乳酸含量则呈极显著的负相关关系(P<0.01)；发酵底物的乙酸和丙酸含量分别与黄曲霉毒素B1含量呈显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)的负相关关系，丁酸含量与黄曲霉毒素B1及玉米赤霉烯酮含量呈极显著的正相关关系(P<0.01)。

表5 FTMR的pH及有机酸含量与霉菌毒素含量的相关性

3 讨论

3.1 FTMR的pH和有机酸含量

pH和乳酸含量是生物发酵饲料品质优劣的重要表征指标，其中pH的降低主要由乳酸积累所致，当pH低于4.20时，有害菌的生长被严格抑制，达到稳定贮存的目的[18]。本试验结果表明，一方面不同碳水化合物结构(NFC/NDF值)条件下，发酵底物的pH均低于4.20，表明各组底物结构基本合理；另一方面，随着饲粮NFC/NDF值的提高，pH整体呈二次降低的趋势，最低点出现在NFC/NDF值=1.60时，这可能是由于厌氧条件下高NFC含量的饲粮可为乳酸菌提供大量迅速发酵底物，促进其繁殖和生长并占主导地位所致，这与多数前人报道的结果[19-21]一致，但这种作用存在顶点效应，即最高的NFC含量并未实现最低的pH和最高的乳酸产量，这可能是由于乳酸菌优先利用高含量的NFC中的大量淀粉和可溶性糖类，迅速促进乳酸积累，但同时过早地反馈性抑制了乳酸菌的生长，使得乳酸积累到后期的时候并达到最大值就进入稳定期。而适宜比例的NFC会在乳酸菌迅速利用易发酵碳水化合物后，乳酸产量并未达到严格限制乳酸菌生长的程度，为NFC中其他缓慢释放的组分赢得了时间，进一步促进了乳酸的积累，上述机制还需进一步开展发酵过程的动态研究进行解析。此外，从复合菌剂添加水平效应看，各复合菌剂添加组pH显著低于未添加组(各复合菌剂添加组间无显著差异)，乳酸产量呈相反趋势，再次印证了前人的研究结果，即外源添加发酵促进型菌剂与物料本身所含有的乳酸菌形成协同效应，加快了发酵进程，促进了发酵程度[22]。

乳酸、乙酸、丙酸和丁酸是厌氧发酵饲料中微生物利用底物养分(氮源和碳源)而产生的主要代谢产物，其中乳酸是产量最高、酸度最大、分子质量最大的有机酸，占主导地位，乳酸产量越高，表示乳酸菌发酵程度越深；而乙酸和丙酸产量则表示发酵类型，丁酸产量与腐败菌、霉菌及酪酸菌的活跃程度呈正相关，即丁酸含量越高物料发酵越不充分、营养损失越大、品质越差[23]。本试验结果显示，乳酸、乙酸和丙酸含量随NFC/NDF值升高呈显著的二次上升，且均以NFC/NDF值=1.60时最高，而丁酸含量则呈相反趋势，主要原因可能是提高NFC含量为乳酸菌和代谢产生乙酸的微生物提供充足的可发酵底物，这与姜富贵等[24]的研究结果一致，同时表示厌氧发酵模式下底物碳源结构是有机酸产量的敏感因素之一，而快速发酵的碳水化合物含量有适宜范围。此外，本试验中复合菌剂添加组的乙酸含量高于未添加组，4和8 g/kg DM复合菌剂添加组的丙酸含量较高，丁酸含量较低，表明复合菌剂有剂量效应，从添加成本考虑，4 g/kg DM的添加量较适宜。

3.2 FTMR的霉菌毒素含量

霉菌毒素是某些真菌微生物在适宜条件下产生的有毒次级代谢产物，饲料在加工、贮藏及运输过程中遭受真菌性病害污染，引发真菌毒素产生，导致其品质劣变；饲用草产品中的真菌毒素不仅对家畜肝脏、肾脏、免疫系统等产生不可逆危害，而且通过食物链蓄积而残留在畜产品中，引发畜产品安全风险，对人类身体健康埋下安全隐患[25]。发酵饲料由于含有适宜霉菌生长的高水分，因此检测霉菌毒素十分必要。本试验重点检测了黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮3种，含量分别为8.36～16.33 μg/kg、417～646 μg/kg、83.15～374.05 μg/kg，均低于我国《饲料卫生标准》[26]规定的限量标准(其他配合饲料中黄曲霉毒素B1≤20 μg/kg，呕吐毒素≤3 000 μg/kg，玉米赤霉烯酮≤500 μg/kg)，表明本试验创造的厌氧条件较适宜。此外，发酵底物的NFC/NDF值显著影响3种霉菌毒素的含量，复合菌剂添加水平以及NFC/NDF值与复合菌剂添加水平的互作效应对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量有显著影响，表明本研究所设计的2个试验因子是调控霉菌毒素产生的重要因素，且当发酵底物的NFC/NDF值=1.60、复合菌剂添加水平为4或8 g/kg DM时霉菌毒素含量最低，这对实际生产具有较大的指导意义。

此外，本研究还分析了构树型FTMR的pH和有机酸含量与霉菌毒素含量的相关性，发现发酵底物的pH与3种霉菌毒素含量呈极显著正相关，而乳酸则呈极显著负相关，乙酸和丙酸含量与黄曲霉毒素B1呈显著或极显著负相关，丁酸含量与黄曲霉毒素B1及玉米赤霉烯酮含量呈极显著正相关，该结果符合多数前人的报道，即厌氧状态下发酵饲料中有机酸含量越高，则有害霉菌的生长被抑制的能力越强[27-28]，因此现实生产中有机酸含量一定程度上可反映发酵饲料的霉菌生长状态，可作为发酵品质的重要评价指标。