低级别胶质瘤SLC12A5的表达及临床意义的生信分析

张 钧 宋国智 常 成

低级别胶质瘤（low-grade glioma，LGG）是颅内常见的原发性肿瘤，肿瘤生物学行为表现出很大的内在异质性[1]。目前，手术切除联合术后放化疗是LGG 的标准治疗方法[2]，已取得一定的进展，但仍存在肿瘤耐药以及肿瘤复发等问题，部分LGG 会发展为高级别胶质瘤[3，4]。靶向治疗是目前最有前景的肿瘤治疗选择之一，新型靶向生物标记物的是LGG 研究的热点。溶质载体家族（solute carrier，SLC）是目前发现的最大的跨膜转运蛋白家族，在各种物质（包括营养物质、离子、代谢物和药物）跨生物膜的交换中发挥着极其关键的作用。溶质载体家族12成员5（solute carrier family 12 member 5，SLC12A5）是SLC成员之一。研究发现，SLC12A5 促进膀胱尿路上皮癌进展、侵袭和转移[5，6]；还与卵巢癌、结肠癌进展有关[7～9]。本文探讨SLC12A5 在LGG 中的表达及临床意义，为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 检索GEPIA数据库GEPIA数据库含来自TCGA和GTEx 项目的9 736 个肿瘤和8 587 个正常样本的RNA 测序数据[10]。通过GEPIA 数据库的“Expression DIY”块分析SLC12A5在LGG中的表达。此外，“survival”模块根据基因表达进行总生存期（over survival，OS）或无病生存期（disease-free survival，DFS）分析。本文将根据SLC12A5的表达中位值分为高表达和低表达，应用Kaplan-Meier 生存曲线分析SLC12A5表达与OS、DSS的关系。另外，GEPIA数据库的“similar Genes”模块用于获取与SLC12A5 相关性最强的50个基因，用于后续进行功能富集分析。

1.2 相互作用网络的构建GeneMANIA（http://genemania.org）是一个开放的、用户友好在线数据库。在该数据库中提交一个基因，GeneMANIA 会使用大量基因组学和蛋白质组学数据查找功能相似的基因并生成基因互作网络图[11]。STRING 数据库收集、评分和整合所有公开可用的蛋白质-蛋白质相互作用信息来源，并通过计算预测来补充这些信息，目标是实现一个全面客观的蛋白互作网络[12]。本文分别利用GEMEMANIA 和STRING 数据库构建SLC12A5 的基因互作网络和蛋白互作网络。韦恩图在线工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）用于获取两个网络中的交集基因。

1.3 Metascape 数据库 Metascape 数 据库（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一个基于web 的门户，提供全面的基因列表注释和分析资源，具有Metascape 功能富集、交互分析、基因注释和成员搜索等功能[13]。本文利用该数据库对SLC12A5及其前50 个相关性最强的基因进行功能注释和通路预测。具体参数设置为：Min Overlap:3；P Value Cutoff:0.01；Min Enrichment:1.5。

1.4 NetworkAnalyst数据库NetworkAnalyst是一个功能强大且用户友好的生物信息学工具，用于基因表达数据的统计、可视化和基于网络的元分析。本文应用NetworkAnalyst 数据库构建转录因子（transcription factor，TF）-miRNA-基因的共调控网络

2 结果

2.1 SLC12A5 在LGG 中表达变化GEPIA 数据库分析显示，与正常对照组相比，SLC12A5在LGG中显著低表达（图1A）。Kaplan-Meier 生存曲线显示SLC12A5 低表达组OS 和DFS 较高表达组均明显缩短（图1B、1C）。

图1 低级别胶质瘤SLC12A5的表达

2.2 SLC12A5 相互作用网络的构建 基因互作用网络分析显示，SLC12A5主要与丝氨酸/苏氨酸激酶39（serine/threonine kinase 39，STK39）、SLC12A7、SLC12A6、SLC12A4、SLC12A3、SLC12A9、SLC12A1、SLC12A2、 CKB、 SLC12A8、 ATP2B2、 GPM6A、KCNC1、TRIM9、RTN1、KCNIP4、DGUOK、SV2B、CDC14A 以及GABRB2 等具有存在相关关系（图2A）。蛋白质互作网络分析显示，SLC12A5 主要与BDNF、EGR4、GABRA1、GABRG2、GABRR3、GAD1、GAD2、GLRA1、GLRA2、GLRA3、GLRA4、GLRB、NLGN2、NTRK2、PPIL4、PVALB、SLC32A1、STK39、WNK1以及WNK3等蛋白存在相关关系（图2B）。基因互作网络和蛋白互作网络靶点的交集分析显示，SLC12A5均与STK39存在相互作用（图2C）。

图2 GeneMANIA数据库构建SLC12A5相互作用网络

2.3 SLC12A5 的共表达分析和功能富集分析 基因共表达分析显示，SLC12A5主要与SYN1、TPR、SNCB以及MAPK8IP2 基因存在较强的相关性（图3A～D）。功能富集分析，SLC12A5 及其共表达基因主要参与化学突触传递、突触小泡周期、认知、细胞连接组织、突触小泡回收以及体液水平的调节等生物学过程（图3E）。

图3 Metascape数据库进行SLC12A5的共表达分析和功能富集分析

2.4 TF-miRNA-SLC12A5 共调控网络的构建NetworkAnalyst 数据库分析显示，XBP1、USF1、TCF3、REST、PPARG、MZF、MEF2A、CREB、CEBPB、ARNT可能是调控SLC12A5表达的潜在TF；而SLC12A5的潜在上游miRNA 包括：hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsalet-7d、hsa-let-7e、hsa-miR-124、hsa-miR-1271、hsa-miR-130a、hsa-miR-130b、hsa-miR-137、hsamiR-139-5p、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsamiR-181c、hsa-miR-181d、hsa-miR-185、hsa-miR-191、hsa-miR-224、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsamiR-301a、hsa-miR-301b、hsa-miR-32、hsa-miR-33、hsa-miR-340、hsa-miR-363、hsa-miR-367、hsamiR-423-5p、hsa-miR-429、hsa-miR-454、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-494、hsa-miR-506、hsa-miR-543、hsa-miR-624、hsa-miR-663、hsa-miR-760、hsamiR-766、hsa-miR-874、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-9、hsa-miR-92、hsa-miR-92b、hsa-miR-937、hsamiR-940、hsa-miR-96以及hsa-miR-98。

图4 NetworkAnalyst 数据库构建转录因子-miRNASLC12A5共调控网络

3 讨论

胶质瘤是颅内常见的原发性恶性肿瘤，具有较高的病死率和复发率，其中LGG 可以演变为高级别胶质瘤并对化疗产生耐药性，这成为多数胶质瘤预后不良的重要原因之一[1～4]。靶向治疗在多种恶性肿瘤中的治疗中显示出了其独特优越性。本文结果显示SLC12A5 可能是LGG 潜在的靶向生物标记物。首先，本文GEPIA 数据库分析发现SLC12A5 在LGG组织中显著低表达；其次，生存分析结果显示SLC12A5 低表达组OS 和DFS 明显缩短。这表明SLC12A5 在LGG 中可能发挥抑癌因子的作用，SLC12A5表达越低，临床预后越差。然后，在基因水平和蛋白水平分别构建了SLC12A5的相互作用关系网络，发现SLC12A5 与STK39 可能存在功能联系。STK39已被证实在包括肾细胞癌、骨肉瘤、乳腺癌和肝细胞癌等多种人类恶性肿瘤发挥重要作用[14～17]。接着，我们筛选了SLC12A5在LGG中的前50个相关基因，结果发现SYN1、TPR、SNCB以及MAPK8IP2与SLC12A5的相关性最强。Yucebas 等[18]证实SYN1在人类胶质瘤中显著下调，且其低表达模式可能维持癌症干细胞样表型，促进胶质瘤的发展。TPR 在维持人胶质瘤的恶性表型中发挥着关键作用，是胶质瘤的新型潜在治疗药物靶点[19]。Fung 等[20]发现SNCB可作为胶质瘤的生物标记物，参与胶质瘤的发生发展。因此，我们推测SLC12A5 可能与STK39、SYN1、TPR、SNCB 以及MAPK8IP2 相互作用共同参与LGG的发生、发展。本文功能分析显示，SLC12A5及其共表达基因主要参与化学突触传递、突触小泡周期、认知、细胞连接组织、突触小泡回收以及体液水平的调节等生物学过程。这些机制可作为理解SLC12A5 调控LGG 发生发展的关键点。最后，我们构建了TF-miRNA-SLC12A5 共调控网络，希望后续能为研究SLC12A5的上下游分子提供思路。

总之，本文发现SLC12A5 具有作为LGG 的预后生物标记物和治疗靶点的潜力。由于缺乏病人的相关临床信息，未能充分分析SLC12A5 表达与病人临床病理特征的相关性，所以，本文仅仅基于生物信息学方法分析的结果，需要进一步研究验证。