刺螫库蠓成虫内部器官系统组织学观察

甯 媛, 李 洪, 李佳豪, 曾雯雯, 邓均杰, 李怡玲,卢 雪, 蒋晓红, 侯晓晖

(遵义医科大学细胞生物学教研室, 贵州遵义 563000)

蠓虫(midges)隶属双翅目(Diptera)长角亚目(Nematocera)蠓科(Ceratopogonidae)，是一类种类繁多、体型微小、孳生地广泛的完全变态类昆虫，除南极洲以外，几乎遍布世界各地。目前，我国已知3亚科39属1 015种，占世界已知蠓种数的21%(虞以新等, 2019; Bernotienetal., 2020; Borkent and Dominiak, 2020)。蠓虫中以嗜吸人、畜血液的吸血蠓危害性最大，其不但可以直接对人畜进行刺叮骚扰，而且作为传播媒介可以传播包括蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)、赤羽病毒(akabane virus, AKV)等在内的多种病毒(Carpenteretal., 2013; Larskaetal., 2013; 段琛, 2019)。上述病毒引发的疾病已在欧洲、非洲等地暴发流行，给当地畜牧业带来巨大的经济损失。此外，吸血蠓还可以传播奥柔普西病毒(Oropouche virus, OROV)等引起蠓媒性人兽共患病，因此吸血蠓具有重要的医学和兽医学研究意义。

刺螫库蠓Culicoidespunctatus是库蠓属Culicoides库蠓亚属Culicoides中一种重要媒介蠓虫，分布于我国多地(河北、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、浙江、福建、山东、湖北、四川、山西、宁夏、云南、新疆、贵州、江西)以及欧洲、非洲多国(虞以新等, 2019)，是施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus, SBV)的主要传播载体，该病毒可以引起牛羊产奶量下降、腹泻或新生幼畜畸形、死胎等(Larskaetal., 2013; 戈胜强等, 2015)。目前，刺螫库蠓的研究多集中在形态学、防制以及性信息素诱捕等方面(常琼琼等, 2017; Borkent and Dominiak, 2020)，缺乏对其内部结构组织学的研究。本研究以刺螫库蠓成虫为研究材料，采用石蜡切片技术对其内部组织结构进行研究，为库蠓的发育研究提供更为直接的材料，有助于提高吸血蠓监测、预报和防制的全面性和准确性。

1 材料与方法

1.1 试虫

本研究所用刺螫库蠓成虫为2019年4-9月采自贵州遵义，参考虞以新等(2005)制作永久玻片后进行形态鉴定，同时选取形态完整的新鲜刺螫库蠓雌性成虫30头、雄性成虫20头用于本实验。

1.2 标本处理和观察

首先去除标本的翅和足，然后按照以下步骤操作：(1)将标本浸入Duboscq-Brasil固定液中，配方为150 mL 80%乙醇、60 mL 4%甲醛、15 mL无水乙酸和1 g苦味酸，常温下固定24 h；(2)经不同浓度梯度乙醇[75%, 80%, 90%, 95%(Ⅰ), 95%(Ⅱ), 100%(Ⅰ)和 100%(Ⅱ)]逐级脱水，期间严格控制脱水时间，其中75%, 80%, 90%和95%(Ⅰ)乙醇中脱水30 min，95%(Ⅱ), 100%(Ⅰ)和100%(Ⅱ)乙醇中脱水20 min；(3)苯透明；(4)55℃石蜡包埋；(5)制备3 μm厚度连续纵、横切片；(6)苏木素-伊红(HE)染色；(7)二甲苯透明。经上述处理后，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

2 结果

刺螫库蠓的内部组织结构主要包括消化系统(digestive system)、神经系统(nervous system)、感觉器官(sensory organs)、呼吸系统(respiratory system)和生殖系统(reproductive system)等。

2.1 消化系统

刺螫库蠓消化系统由消化道(digestive tract)和唾液腺(salivary glands)组成，整个消化道从口器到肛门纵贯于体腔中央，分为前肠(foregut)、中肠(midgut)和后肠(hindgut)3个部分，消化道有曲折回旋。消化道经HE染色后细胞质被染成粉红，细胞核被染为蓝紫色，形态清晰。

2.1.1前肠：主要由口器(mouthparts)、咽(pharynx)、食窦(cibarium)、食道(esophagus)、贲门(cardia)、贲门瓣(cardiac valve)和嗉囊(crop)7个部分组成。口器(图1: A)又称喙，刺吸式，由上颚、下颚、舌、上唇和下唇组成。口器连接咽部，咽部上管壁向管腔突起部分为食窦(图1: B)，食窦与体壁之间有肌肉连接，HE染色后肌肉呈粉红色(图1: B)。咽部后连接食管，食管呈管状结构，咽与食管的连接处位于头部和胸部之间(图1: C)，食管细胞以单层上皮细胞为主(图1: D)。贲门(图1: C)是前肠和中肠的分界线，前肠与中肠的连接处肠壁向内凹陷形成贲门瓣(图1: C)。此外，贲门前方有嗉囊的开口(图1: E)，嗉囊紧贴中肠向后延伸，末端在腹部膨大呈圆形囊状，内部多褶皱。

2.1.2中肠：中肠是消化道中最发达的部分，是消化食物和吸收营养的主要场所，从胸部一直向后延伸到腹部。前端以前肠的贲门瓣为界，后端以后肠为界，根据其形态不同将整个中肠分为2个区域(图1: F)：第1区域在前部，位于胸部比较狭窄的部分；第2区域在后部，位于腹部管腔较扩大的部分，中肠肠壁细胞以单层柱状上皮细胞为主，细胞排列整齐，核大而圆，多位于细胞中部或基底部，细胞质染色较浅(图1: G)。

2.1.3后肠：后肠由前至后依次为回肠(ileum)、结肠(colon)和直肠(rectum)。前端连接中肠，后端止于肛门。回肠与结肠分化不明显，因此不易区分(图1: H)，肠壁细胞以单层立方上皮细胞为主(图1: I)。直肠前端膨大形成直肠囊，内壁上着生卵圆形腺体，称为直肠垫(rectal pad)(图1: J)。直肠垫顶部深入直肠腔中，表面内膜薄。直肠囊逐渐变窄，最后终止于肛门处。直肠上皮较为扁薄(图1: J)，上皮细胞以扁平细胞为主。

2.1.4唾液腺：唾液腺分为左右两个腺体，位于胸部前足上方食道附近，由唾液腺管道汇集而成，连通口器附近的唾液泵。每个腺体可分为2个部分，即主腺(main glands)和附腺(accessory glands)。主腺(图1: K)以葡萄状腺泡为主；附腺(图1: L)为导管基部的突起。

2.2 神经系统

蠓虫神经系统包括中枢神经系统(central nervous system)、外周神经系统(peripheral nervous system)和交感神经系统(sympathetic nervous system)。本研究仅对刺螫库蠓成虫的中枢神经系统做了初步观察。成虫的中枢神经系统由脑(brain)和腹神经索(ventral nerve cord)构成。脑和各体神经节组织学结构相似，由外到内依次为神经鞘(nerve sheath)、神经细胞体(neurocyte)层和神经髓质(neuropile)层。经HE染色后，神经鞘内侧的神经细胞体层为蓝色颗粒状，而中央神经髓质层为粉红色胶状物质，连接神经节之间的神经索则为粉红色。

图1 刺螫库蠓成虫消化系统组织切片Fig. 1 Tissue sections of the digestive system of adult Culicoides punctatusA: 口器Mouthparts; B: 咽部Pharynx; C: 贲门Cardia; D: 食管横切Transverse section of esophagus; E: 嗉囊Crop; F: 中肠Midgut; G: 中肠横切Transverse section of midgut; H: 后肠Hidgut; I: 后肠横切Transverse section of hidgut; J: 直肠Rectum; K: 主腺Main glands; L: 附腺Accessory glands. Br: 脑Brain; Ca: 贲门Cardia; Ci: 食窦Cibarium; Cr: 嗉囊Crop; Cv: 贲门瓣Cardiac valve; Es: 食道Esophagus; Hg: 后肠Hidgut; Mg: 中肠Midgut; MgⅠ: 中肠1区The first region of midgut; MgⅡ: 中肠2区The second region of midgut; Mgs: 主腺Main glands; Mp: 口器Mouthparts; Mu: 肌肉Muscle; Ph: 咽Pharynx; Re: 直肠Rectum; Rp: 直肠垫Rectal pad; Ags: 附腺Accessory glands.

2.2.1脑： 脑位于头部，在咽部上方，又称为食管上神经节，外层覆盖坚硬的脑壳，被大量肌肉组织包围，可明显区分为前脑(protocerebrum)、中脑(deutocerebrum)和后脑(tritocerebrum)。前脑构成脑的大部分，可为前脑叶(protocerebral lobe)和视叶(optic lobe)，发出神经与复眼(compound eye)连接，分为左右两个半球。复眼为刺螫库蠓的感光器，由许多小眼面构成(图2: A)，小眼面从内到外分别为内膜、晶锥细胞(crystal cone)、晶体(crystal)和角膜(cornea)，经HE染色后内侧的晶锥细胞为黑色，晶体为蓝色，外层弧形角膜则为红色(图2: B)。前脑叶髓质层(图2: E)是由神经细胞和神经纤维束形成的脑体，结构极其复杂，包括1对蕈形体(mushroom body)、1个中央复合体(central complex)和1对附叶(accessory protocerebral lobe)组成。视叶(图2: C)由视内髓前叶(anterior lobe of medulla interna)、视内髓后叶(posterior lobe of medulla interna) (图2: D)、视外髓(medulla externa)以及视神经节层(lamina)组成，视外髓与视内髓之间形成内神经交叉(inner chiasma)(图2: C)，视外髓与视神经节层之间形成外神经交叉(outer chiasma)(图2: C)，视神经节层发出神经纤维与复眼连接。中脑位于前脑内侧(图2: F)，由中脑叶(dorsal lobe)和触角(antennae)中枢组成，发出神经至触角，为触角的神经中枢。触角是吸血蠓的另一个感觉器官，以触角柄节(scape)处神经节居多(图2: G, H)。后脑向后发出围食管神经索(circumoesophageal connective)，绕过咽部与食道下神经节相连。

2.2.2腹神经索： 腹神经索由左右2根神经干上的神经节融合而成，由1个食管下神经节(又称咽下神经节)、3个胸神经节以及5个腹神经节组成。食管下神经节(suboesophageal ganglion)为腹神经索中第1个神经节，神经纤维极为丰富(图2: I)。胸神经节(thoracic ganglion)在胸腔内高度融合(图2: J, K)，极其发达，容易区分，3个神经节分别位于前、中、后胸(图2: J)，与前、中、后足相对应，发出神经纤维向腹面伸入足内，向背面伸入翅基部。腹神经节(abdominal ganglion)(图2: L)极不发达，神经纤维主要分布到腹部各个内脏器官。腹神经节与气管等组织相互缠绕，较难观察与分离。

图2 刺螫库蠓成虫神经系统和感觉器官组织切片Fig. 2 Tissue sections of the nervous system and sensory organs of adult Culicoides punctatusA: 复眼Compound eye; B: 复眼纵切Longitudinal section of compound eye; C: 脑部纵切Longitudinal section of brain; D: 前脑Protocerebrum; E: 脑部横切Transverse section of brain; F: 中脑Deutocerebrum; G: 柄节纵切Longitudinal section of scape; H: 柄节横切 Transverse section of scape; I: 食管下神经节Suboesophageal ganglion; J: 胸神经节(侧面观)Thoracic ganglion (side view); K: 胸神经节(正面观)Thoracic ganglion (anterior view); L: 腹神经节Abdominal ganglion. Ag: 腹神经节Abdominal ganglion; An: 触角Antennae; Ap: 附叶Accessory protocerebral lobe; Cc: 中央复合体Central complex; Ce: 复眼Compound eye; Co: 角膜Cornea; Cr: 晶体Crystal; Crc: 晶锥细胞Crystal cone; Dl: 中脑Deutocerebrum; gaⅠ: 前胸神经节Prothoracic ganglion; gaⅡ: 中胸神经节 Mesothoracic ganglion; gaⅢ: 后胸神经节Metathoracic ganglion; Ic: 内神经交叉Inner chiasma; La: 视神经节层Lamina; Mb: 蕈形体Mushroom body; Me: 视外髓Medulla externa; Mia: 视内髓前叶Anterior lobe of medulla interna; Mip: 视内髓后叶Posterior lobe of medulla interna; Oc: 外神经交叉Outer chiasma; Sc: 柄节Scape; SG: 食管下神经节Suboesophageal ganglion.

2.3 呼吸系统

刺螫库蠓成虫胸部具有2对气门(spiracle)，分别位于后胸(图3: A)和中胸(图3: B)。气囊主要包括背支囊(back sac)和腹支囊(air sac)，由于背支囊与腹支囊组织呈管状或泡状，HE染色后着色不明显，切片时很难切到完整的器官。

2.4 生殖系统

刺螫库蠓生殖系统包括外生殖器官和内生殖器官两部分，由生殖腺和附腺组成。本文主要介绍内生殖器官。雌雄两性内生殖器官在解剖学上差异很大。HE染色下，受精囊被染为红色，卵巢染为紫色，精巢则被染为蓝色。

图3 刺螫库蠓成虫呼吸系统和生殖系统组织切片Fig. 3 Tissue sections of the respiratory system and reproductive system of adult Culicoides punctatusA: 气门纵切Longitudinal section of spiracle; B: 气门横切Transverse section of spiracle; C: 受精囊Spermatheca; D: 受精囊(高倍镜下观察)Spermatheca (at high magnification); E: 卵巢纵切Longitudinal section of ovary; F: 精巢Testes. O: 卵巢Ovary; S: 气门Spiracle; Sp: 受精囊Spermatheca; T: 精巢Testes.

2.4.1雌性内生殖器官：包括卵巢(ovary)、输卵管(fallopian tube)、受精囊(spermatheca)和生殖附腺(accessory gland)。卵巢(图3: E)，呈卵圆形，壁薄，左右各一对称分布，由数个短卵巢管组成，与输卵管相连。两条输卵管基部汇合并连通阴道。受精囊(图3: C, D) 2个，均呈圆形，与受精囊管相连，开口于阴道处。生殖附腺1对，也开口于阴道处。

2.4.2雄性内生殖器官：包括精巢(testes)、输精管(vas deferens)、射精管(ejaculatory duct)和生殖附腺。精巢(图3: F)呈淡蓝色，左右各一对称分布，其先连接输精管，后者再汇合为1根射精管，最后开口于阳茎。生殖附腺位于射精管两侧，开口于射精管。

3 讨论与结论

组织切片法是研究细胞与组织形态等最基本的方法，该方法能够完整地保持组织的原始形态结构，同时还能较好地保存实验材料的DNA、蛋白质等分子信息，这为利用原位杂交、免疫组化等技术研究相关基因的表达与分布提供了良好的基础条件(黄淇和赵瑞波, 2002)。目前关于昆虫石蜡切片的研究已有诸多报道(闫亮珍等, 2011; 胡蓉等, 2013; 寻慧等, 2013; 李俊, 2016)。刺螫库蠓虫体小而轻，表面具一层坚硬的几丁质外壳，常规石蜡切片技术很难达到良好的实验效果，经过反复的试验，摸索出一套针对蠓科昆虫的石蜡切片及染色技术，为更好地对蠓科昆虫内部结构的组织学进行研究提供了基础资料。首先，选取合适的固定液，即Duboscq-Brasil固定液，该固定液对组织的穿透能力较强，能够完全浸入昆虫体内(寻慧等, 2011; 闫亮珍等, 2011)，达到良好的固定效果。其次，严格控制脱水时间，由于虫体小而轻，脱水时间把控合适有利于后续标本处理。最后，控制HE染色时间，保证组织的染色效果，若染色时间过长将导致染色过深而影响观察。

组织切片结果显示刺螫库蠓消化系统主要由消化道和消化腺构成(图1)，消化道具有运送、消化食物、吸收营养以及控制水分和离子平衡等功能，明显长于体长，分为前肠、中肠以及后肠，这一特征与双翅目中较高阶元的消化道特征(褚梦颖, 2016)相吻合。刺螫库蠓口器为刺吸式，咽部与体壁之间有肌肉连接，特化成咽喉唧筒，具有吸食作用。刺螫库蠓的嗉囊发达，由一条嗉囊管及其末端的囊状结构组成，内表面褶皱，多纵脊，与Chapman(1998)报道双翅目昆虫的嗉囊为食道后方一突出的圆球形支囊结果一致。同时，嗉囊管的长短随种类的不同而异，且不同个体嗦囊大小也存在差异。此外，刺螫库蠓消化道中不存在胃盲囊(gastric cecum)结构，该结构的有无以及数量多少在双翅目昆虫中具有较大差别(薄新文等, 2000; 褚梦颖, 2016)。由于胃盲囊的主要作用是通过增加中肠的表面积来辅助其消化吸收，而对于取食液体食物的昆虫可以没有胃盲囊结构，这也恰好解释了本研究中刺螫库蠓为何无该结构。刺螫库蠓的脑与大多数昆虫的结构(褚梦颖, 2016)类似，可以区分出3个典型的功能区：前脑、中脑和后脑；胸神经节在胸部高度融合，表明其对运动的控制作用较强，不同类群的胸神经节合并情况有所不同(图2)。内生殖器官的结构在性别以及种间具有明显差异(图3)，雌性成虫体内可以观察到2个圆形的受精囊，雄性成虫精巢内部着色深浅不一，由此推测，不同深浅颜色代表其精子发育成熟度有所不同。刺螫库蠓的呼吸系统虽遍布全身，但由于虫体微小的限制，本研究中仅观察到气门的结构，该系统还有待进一步研究。

复眼和触角作为昆虫的感觉器官，前者是吸血蠓的主要感光器，能感受物体的大小、形状和颜色，对昆虫的取食、觅偶、产卵、归巢和避敌等行为起着重要的作用(Jia and Liang, 2017)。复眼由成千上万只小眼面组成，由外向内依次为角膜、晶体、晶锥细胞和内膜，这与致倦库蚊复眼的特征(闫亮珍等, 2011)一致。不同种类昆虫复眼的可见光谱范围不同，由于吸血蠓对紫外光部分的短光波有强烈反应，故在吸血蠓防制中就是利于这一点对其进行紫外光诱杀。触角是蠓虫另一个重要的感觉器官，可以感受环境中的湿度和温度，并产生相应的化学变化，对寻找食物、血源或栖息地等起到重要作用(Gullan and Cranston, 2015)，本研究在组织切片中也观察到神经元多集中在触角柄节位置。

本研究系统地观察了刺螫库蠓的消化系统、神经系统、呼吸系统、生殖系统以及感觉器官的组织结构特征，不仅为后续基因定位、免疫组化等研究提供了实验材料，同时为该类群物种发育研究提供了可靠数据。