补阳还五汤入脑成分治疗缺血性中风潜在机制的网络药理学分析与验证❋

代雅洁， 刘振权， 江 洋， 于 雪， 王淑艳， 汤轶波

(北京中医药大学， 北京 100029)

近年来，缺血性中风(ischemic stroke，IS)的发病率呈逐年上升，发病年龄呈年轻化趋势[1]，给患者带来巨大的痛苦，也给社会带来了沉重的负担，已经成为当今医学亟待解决的一大难题[2，3]。IS是一种由于局部脑组织血流供应不足或中断而引起相应脑组织大量神经细胞死亡的疾病[4，5]。IS可引起一系列的病理生理变化，包括能量代谢障碍、炎症反应、兴奋性氨基毒性作用、氧化应激、细胞凋亡等[6]，最终导致神经功能障碍[7，8]。目前临床主要的治疗方法是溶栓治疗、取栓治疗和抗血小板凝集治疗，目的是及时有效地清除血栓或栓塞引起的血流阻断[9]，但这些措施很难有效改善IS病灶形成后的病理损伤。中药复方对IS的治疗有其独到的作用，如血府逐瘀汤、星蒌承气汤和补阳还五汤(buyang huanwu decoction，BYHWD)等方剂在动物实验和临床治疗中都发挥了良好的疗效[10]。通过科学配伍，中药中的有效成分可以共同发挥作用，有效干预IS的进展和预后。不同的中药可以含有相同的成分，不同的成分也可以有相同或不同的作用靶点，因此中药复方在治疗疾病的过程中会形成一个独特而复杂的网络。通过这个网络，能够分析中药复方的作用机制，探究中药复方与疾病的关系，这种研究方法称为网络药理学[11]。

BYHWD出自清代名医王清任的《医林改错》，原方具有补气活血、活血通络的功效，是治疗气虚血瘀型中风的经典名方[12]。目前，国内外学者对于BYHWD干预IS的机制探索也已达到分子水平[13，14]，但对于BYHWD治疗IS所涉及的作用靶点和信号通路的研究还值得进一步深入。本文立足于网络药理学，以BYHWD治疗IS的有效入脑成分-作用靶点-信号通路为研究对象，探讨BYHWD治疗IS的作用机制，针对网络药理学预测到的凋亡通路进行动物实验验证。

1 方法

1.1 BYHWD入脑成分的获取筛选及靶点预测

利用TCMSP数据库(http：//tcmspw.com/index.php)[15]，检索BYHWD中各味中药的成分，以口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18、血脑屏障通透率(BBB)>-0.30[16，17]为限定条件对其进行筛选，获取入脑成分及其作用的蛋白靶点。通过化学专业数据库(http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/main/ tcm_introduce.asp)[18]获取“地龙”的成分信息，借助Swiss数据库(http：//www.swissadme.ch/、http：//www.swisstargetprediction.ch/)[19，20]对地龙的成分进行筛选。通过Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)[21]对获取的蛋白靶点进行规范命名。

1.2 IS相关靶点的筛选

以“ischemic stroke”“ischemic brain damage”为关键词，运用DiGSeE数据库(https：//210.107.182.61/geneSearch/)[22]、OMIM数据库(http：//www.omim.org)[23]、TTD数据库(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[24]、DRUGBANK 数 据 库(https：//www. drugbank.ca)[25]挖掘IS的相关靶点。利用Venny平台(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，对检索出的BYHWD成分靶点和IS相关靶点取交集并绘制韦恩图，交集靶点被视为BYHWD治疗IS的潜在靶点。

1.3 药物-成分-靶点-疾病可视化网络构建

将BYHWD的药物组成、入脑成分以及潜在靶点导入Cytoscape3.7.2[26]软件，构建BYHWD治疗IS “药物-成分-靶点-疾病”网络图(见图2)。

1.4 潜在靶点蛋白互作网络构建与KEGG通路的富集分析

将潜在靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/)[27]构建蛋白互作(protein protein interaction, PPI)网络，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9)，删除无关联的靶点，其他参数保持默认设置。借助Metascape数据库(http：//metascape.org/gp/index.html)[28]对潜在靶点进行KEGG通路分析，将分析结果导入微生信在线平台(http：//www.bioinformatics.com.cn/)绘制KEGG富集分析高级气泡图。

1.5 动物实验验证

成年雄性SD大鼠购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物许可证号SYXK(京)2016-0038。BYHWD购自北京同仁堂药店；依达拉奉(阳性药)购自南京先声东元制药有限公司(批号80-181203)。将实验动物分为假手术组、模型组、BYHWD组和依达拉奉组，通过大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型模拟IS，假手术组大鼠仅分离颈总动脉和颈外动脉，不插入线栓。用BYHWD(12.8 g/kg/qd)和依达拉奉(0.6 mg/kg/qd)分别对MCAO大鼠进行干预。术后7 d大鼠麻醉后取脑，将缺血侧脑皮质总蛋白提取后使用BCA法测定蛋白浓度，使用10% SDS-PAGE进行电泳，80 V/30 min浓缩胶电泳，120 V/60 min分离胶电泳。电泳结束后80 V恒压湿转90 min，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL发光法进行曝光，以磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylation extracellular regulated protein kinases，pErk)条带与总Erk条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量[29，30]。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 BYHWD化学成分的获取与筛选及靶点预测结果

通过检索TCMSP和化学专业数据库，获得BYHWD中7味中药各自对应的有效活性成分共802种，经筛选去重后得到BYHWD共38个入脑成分，其中包括芒柄花素(Formononetin)、黄芩素(Baicalein)、亚麻酸(Linolenic acid)、棕榈酸(Palmitic acid)等(见表1)。检索到黄芪(Radix Astragali)成分作用靶点73个，赤芍(Radix Paeoniae Rubra)72个，川芎(Chuanxiong Rhizoma)30个，当归(Angelicae sinensis Radix)51个，桃仁(Persicae Semen)44个，红花(Carthami flos)91个，地龙(Pheretima)139个共500个，合并后删除重复值共得到靶点242个。

表1 BYHWD入脑成分基本信息

2.2 IS相关靶点的筛选结果

从DiGSeE数据库获取IS相关靶点227个，通过OMIM数据库检索到634个相关靶点，TTD数据库14个，Drugbank数据库61个。合并后删除重复值，最终得到816个IS相关靶点。将其与BYHWD的作用靶点取交集后共获得60个(见图1)。

图1 BYHWD与IS韦恩图

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络图构建结果

通过Cytoscape3.7.2，构建BYHWD治疗IS潜在靶点网络图(见图2)。图中红色节点代表IS；粉色节点代表BYHWD治疗IS的潜在靶点；紫色节点代表BYHWD的药物组成；黄色节点代表各种入脑的成分。其中常春藤素(Hederagenin)、豆甾醇(Stigmasterol)、谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)是2味及以上药物的共有成分。

注：HQ代表黄芪，CX代表川芎，TR代表桃仁，HH代表红花，CS代表赤芍，DL代表地龙，GY代表共有成分图2 BYHWD治疗IS潜在靶点网络图

2.4 潜在靶点PPI网络构建结果与KEGG通路的富集分析

将潜在靶点导入STRING 11.0数据库，得到BYHWD治疗IS的PPI网络(见图3)。对潜在靶点进行KEGG通路富集分析，初次富集到122条信号通路，其中P值排名前20的通路基本信息(见表2)。因KEGG富集分析结果排名前20的信号通路大多与癌症相关，不能充分体现BYHWD治疗IS的作用机制，故查阅文献[31]，在122条具有统计学意义的信号通路中，选取与BYHWD治疗IS相关性更高的20条信号通路，作为KEGG富集分析结果并进行展示(见图4)。根据KEGG富集结果，绘制系统的BYHWD治疗IS的主要信号通路图(见图5)。KEGG富集通路主要包括白细胞介素(interleukin, IL)-17信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路、缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1信号通路、糖尿病并发症中晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(advanced glycosylation end products-receptor of advanced glycosylation end products,AGE-RAGE)信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路等。图5示，MAPK信号通路是主要的差异通路之一，同时还与其他信号通路串扰，共同参与IS的进展。

图3 BYHWD治疗IS的PPI网络图

2.5 Western blot法检测BYHWD对IS后MAPK/Erk信号通路的影响结果

研究表明[32]，IS发生后中心缺血区域发生细胞坏死、半暗带区域则出现细胞凋亡。通过调控半暗带缺血区相关细胞凋亡信号通路，可以减轻脑缺血损伤[33]。综合BYHWD治疗IS相关的KEGG富集通路结果来看，MAPK信号通路与细胞的生长繁殖和分裂死亡密切相关，值得进一步去探究。

MAPK信号通路主要由P38 MAPK、氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，Jnk)以及Erk3条信号通路组成[34]。其中有研究表明，Erk信号传导通路可在颅脑外伤、脑缺血/再灌注损伤、渗透压变化和生理应激等情况下激活，在多种神经系统疾病脑损伤的过程中都发挥着重要作用[35-38]。

为探索BYHWD在治疗IS过程中对细胞凋亡的调控作用，故采用Western blot技术对MAPK/Erk信号通路进行实验验证。

表2 KEGG信号通路基本信息(P值排名前20)

图4 BYHWD治疗IS相关的KEGG富集通路气泡图

注：紫色节点代表与BYHWD治疗IS相关的靶点，白色节点代表与IS相关的靶点图5 BYHWD治疗IS的主要信号通路图

结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠pErk表达显著升高(P<0.001)，说明IS后激活了MAPK/Erk信号通路；与模型组比较，BYHWD组和依达拉奉组大鼠脑组织中pErk表达明显降低(P<0.01)，但各组大鼠缺血侧脑皮质中总Erk没有明显差异(如图6)。

注：与假手术组比较：***P<0.001；与模型组比较：##P <0.01图6 BYHWD对IS大鼠缺血侧脑皮质MAPK/Erk通路的影响(n=3)

3 讨论

血脑屏障(blood brain barrier, BBB)是一种选择性渗透屏障。一方面BBB允许血液中脑组织所需要的营养物质等通过；另一方面能阻挡有害物质的侵入，从而维持中枢神经系统(central nervous system, CNS)内环境的稳定。但也由于BBB的存在，许多药物无法或难以穿过BBB，因此在脑内浓度较低，不能充分发挥治疗作用。

BYHWD由黄芪、赤芍、川芎、当归尾、桃仁、红花、地龙等7味中药组成。方中黄芪为补气要品，大补脾胃之元气，令气旺血行，瘀去血通；当归尾善于活血，且有化瘀而不伤血的特点。川芎、赤芍、桃仁、红花4味中药佐助当归尾活血祛瘀，配以地龙通经活络，全方合伍共奏补气活血通络之功。前期网络药理学研究发现[39]，BYHWD有效成分可以从多环节、多靶点发挥治疗IS的作用，但其中部分成分相对分子量较大，脂溶性较低，难以透过BBB，这些成分是否能真正在病变组织处发挥药理作用还有待商榷。因此，以BYHWD可入脑成分为介入点阐述其治疗IS的药效物质基础具有更好的科学性。

通过TCMSP和化学专业数据库共收集到BYHWD入脑成分38种，涉及黄酮类化合物黄芩素、异黄酮类化合物芒柄花素以及不饱和氨基酸亚麻酸、棕榈酸等生物活性物质。黄芩素具有很好的抗炎和抗氧化抗凋亡的药理作用，不仅能够通过抑制肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、IL-17、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)9等炎性介质的产生和调节核因子(nuclear factor-kappa B, NF-κB)信号通路等方式发挥抗炎作用[40]，还可改善神经功能缺损，减少脑含水量和梗死面积[41]，具有神经保护作用。芒柄花素广泛存在于黄芪中，具有降血脂、抗炎以及清除自由基的药理作用，能够抑制血管平滑肌细胞增殖，改善动脉粥样硬化病变[42]，对心脑血管具有一定的保护作用[43]。这为BYHWD治疗IS提供了新的药理学基础。另外，临床研究[44]发现，膳食多不饱和脂肪酸能够降低急性缺血性卒中或短暂性脑缺血发作患者血清C反应蛋白(c-reactive protein, CRP)及高半胱氨酸(homocysteine, HCY)水平，其药理学作用还有待进一步研究。

KEGG信号通路富集分析结果涉及IL-17信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路、缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1信号通路、糖尿病并发症中晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(advanced glycosylation end products-receptor of advanced glycosylation end products, AGE-RAGE)信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路和MAPK信号通路等。KEGG信号通路富集分析结果表明，BYHWD能够介导多条信号通路，从而发挥治疗IS的作用。脑缺血发生后，固有淋巴细胞首先被激活，继而通过递呈抗原激活适应性免疫，IL-17信号通路是中风后固有免疫和适应性免疫之间的桥梁，发挥着关键作用[45]。已有实验证实，IL-17在MCAO大鼠大脑和外周血循环中表达明显升高[46]，下调IL-17的表达，能够促进中风小鼠海马神经的生发[47]，因此抑制IL-17信号通路可能是防治IS的重要途径。在IS的急性阶段，炎症反应是继发性神经元损伤的重要因素[48]，PI3K/Akt信号通路是经典的炎症通路，在细胞增殖、分化、凋亡过程中都发生着重要作用[49]。有研究发现，BYHWD可能通过调控PI3K/Akt通路，发挥抗脑缺血损伤的作用[50]。HIF-1在缺氧环境下广泛存在于人体中，调节细胞氧平衡，调节机体对缺氧的反应，并诱导缺氧基因的表达[51]。糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路的激活，将导致晚期糖基化终产物的过量产生进而加重IS[52]；神经活性配体-受体相互作用信号通路是质膜上与细胞内和细胞外信号通路相关的受体配体的集合，在生理上与神经功能密切相关[53]。上述结果表明，BYHWD可以通过调节炎症反应、氧化应激等过程，从而达到治疗IS的作用。

MAPK超家族广泛分布于细胞的胞浆内，是引起细胞各种生物学反应的重要信号传导系统，Erk是其亚家族之一。Erk信号通路在调节基因转录、神经细胞的凋亡和学习记忆功能等方面具有潜在作用[54]。在本实验中，大鼠IS发生后，缺血侧脑皮质中pErk表达显著升高，说明Erk通路在IS后开始活化。经BYHWD治疗后，大鼠缺血侧脑中pErk表达明显降低，Erk通路受到抑制。

综上所述，BYHWD中各种成分协同配伍，其有效化合物成分在通过肝脏代谢后透过BBB作用于不同的靶点和通路，发挥治疗IS的药理作用。基于本研究网络分析预测的结果，结合文献数据分析，可以推测BYHWD通过抗炎、抗氧化应激等生物学途径减少神经细胞凋亡、坏死，减轻脑水肿，改善神经功能损伤；通过参与炎症反应、氧化应激反应和抗凋亡干预IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路和MAPK信号通路，发挥神经保护作用，为BYHWD临床干预IS提供一定的理论依据。