采用网络药理学方法预测苏格木勒-10治疗肾病综合征的机制

良 良，鲍布日额，陈香梅，王秀兰

（1.内蒙古民族大学 附属医院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学 蒙医药学院，内蒙古 通辽 028043）

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是由复杂病因致肾小球基底膜的通透性增加的常见肾小球疾病之一，主要表现为大量蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症和水肿［1］。NS发病机制复杂，主要与足细胞损伤与凋亡、脂质代谢紊乱和氧化应激等有关［2］。目前NS的治疗以免疫抑制剂为主，作用尚可但其毒副极其严重［3］。寻求安全、有效、毒副作用小的药物迫在眉睫。蒙医具有辨证施治，蒙药复方涉及多组分、多靶向治疗作用等特点。

苏格木勒-10是一味历史悠久的蒙医验方，由味苦、辛、性温、轻、躁、腻、锐，有祛肾寒、抑赫依、调胃火、消食、开胃、止吐之功效的苏格木勒为君药，具治疗尿闭、祛肾寒功效，是蒙医广泛用于治疗泌尿系感染、肾寒、肾炎、肾结石的常用药物［4-10］。虽然苏格木勒-10临床疗效显著，但目前其分子机制研究少见。笔者以苏格木勒-10的化合物为基础，肾病综合征疾病靶点为研究对象，采用中医药整合药理学研究平台建立化合物-靶点-疾病靶点-通路网络，初步探讨苏格木勒-10复杂成分、多作用靶点、多通路的作用机制，为深入研究苏格木勒-10治疗NS的作用机制提供方向。

1 材料与方法

1.1材料 中医药整合药理学研究平台，见表1。

表1 中医药整合药理学研究平台Tab.1 Integrated Pharmacology Research Platform of Traditional Chinese Medicine

1.2 苏格木勒-10化合物数据库建立 从TCMSP、BATMAN数据库中获取苏格木勒-10的化学成分，输入关键词“益智、干姜、荜茇、冬葵果、莲子、榧子、苦石莲、麝香、方海、白硇砂”及文献检索其化合物得到活性成分信息，再经过口服生物利用度（OB）和类药性（DL），筛选出同时满足OB≥20%和DL≥0.1的化合物及文献报道的有活性的成分［11-14］。

1.3 成分靶点筛选 将“1.2”项下化合物导入Pubchem数据库，导出分子结构并以Canonical SMILES格式保存文件，导入Swiss、Sea数据库，选定物种为“Homo sapiens”，筛选条件probablity＞0.1，得到成分的对应靶点，保存数据，筛选、整合、去重后得到化合物潜在作用靶点。

1.4 疾病靶点筛选 使用DisGeNET、OMIM、Gene Cards数据库中输入关键词“Nephrotic syndrome”“Edema”“Proteinuria”进行检索，搜索已报道与NS相关的基因，去除重复基因获得作用靶点，将其导入Excel表格中，整合、去重后得到疾病的潜在作用靶点。

1.5 潜在作用靶点筛选及网络模型构建及分析 利用Venny2.1.0软件获取苏格木勒-10化合物和肾病综合征交集靶点（即两者共同靶标），即为潜在靶点。继而将潜在靶点及其对应化合物分别导入Cytoscape 3.6.0软件，构建“成分-靶点”网络，使用Network Analyzer功能对网络进行分析，根据节点Degree、Betweenness、Closeness筛选出苏格木勒-10防治NS的主要活性成分。

1.6 PPI网络构建及分析 将“1.5”项筛选到的共同靶点输入STRING数据库，选择“homo sapiens”物种，设定最低相互作用阀值为0.15，其余参数保持默认设置，获得蛋白相互作用信息，保留文件中的节点信息（node1、node2）并将其导入Cytoscape 3.6.0软件，构建PPI网络并进行拓扑分析，筛选出关键靶点。

1.7 富集分析 将筛选得到的关键靶点输入DAVID数据库中，进行GO功能富集分析（包括生物过程、细胞组分、分子功能）和KEGG信号通路分析。

2 结果

2.1 苏格木勒-10方中成分及靶点的筛选 通过借助名称TCMIP（V2.0）、BATMAN数据库及文献检索筛选出178个化合物，其中益智化合物11个、荜茇15个、白硇砂化合物1个、冬葵果化合物14个、榧子化合物11个、干姜化合物19个、苦石莲化合物26个、莲子化合物22个、螃蟹化合物19个、麝香化合物40个，去重后得126个化合物，将苏格木勒-10复方化合物Canonical SMILES结构输入Swiss、Sea数据库中检索得到化合物靶点，筛选物种为“Homo sapiens”，propbolity＞0.1的，去重后基因共有997个。

2.2 疾病靶点筛选 通过DisGeNET、OMIM、Gene Card数据库筛选“Nephrotic syndrome”“Edema”“Proteinuria”得到疾病靶点180个，去重后162个，将疾病和成分的靶点输入Venny 2.1.0，获取共同靶点35个，见图1。

图1 苏格木勒-10和NS交集靶点Fig.1 Intersection targets of Sugemule-10 and NS

2.3化学成分-作用靶点网络构建及分析 将化合物和35个潜在靶点导入Cytoscape软件，绘制网络图，见图2，并对网络进行拓扑分析。结果显示，亮氨酸、亚麻酸、6-methyl-1-（2-thenylidene）furo［3，4-c］pyridine-3，4（1H，5H）-dione分别能与11、7、6个以上靶点相连接，油酸、Vitexin-2-O-rhamnoside、芥酸、己酸、2，7-二甲基辛基-7-烯-5-炔-4-基酯、氯甲基3-氯辛酸分别与5个靶点连接，胡椒碱、豌豆素等与4个靶点连接，胡椒龙胺、姜黄素、诺卡酮、氧叶酮B、氧叶酮A分别与3个靶点连接，可能在防治肾脏疾病过程中发挥重要作用，同时亮氨酸、亚麻酸、姜黄素、姜黄醇、诺卡酮、胡椒碱、豌豆素、胡椒龙胺、白杨素、鼠李素、6-姜酚、β-谷甾醇、氧叶酮B、氧叶酮A等25个成分又可共同作用于靶点NOS2，体现了苏格木勒-10多成分、多靶点的综合调节特点。

图2 苏格木勒-10活性成分治疗NS潜在靶点Fig.2 Potential targets of Sugemule-10 active ingredients for treatment of NS

2.4 PPI网络构建 在STRING数据库中录入35个潜在作用靶点，得到蛋白相互作用信息，使用Cytoscape软件对上述数据进行可视化分析，构建PPI网络，并对网络进行筛选，根据连接度（Degree）、介度（Betweeness）、紧密度（Closeness）筛选出35个关键靶点，见表2，其中度值最高的为TNF与33蛋白结合，其次为MMP9、ICAM1、CXCL8、PTGS2、VEGFA、IL6、ACE、REN、CASP3、RHOA、TGFB1、NOS2、PPARA、NR3C1能与25个以上蛋白发生相互作用。PPI网络图见图3、图4，靶点度值越高，节点越大；度值越低，节点越小。

图3 35个蛋白之间相互作用图Fig.3 Interaction diagram between 35 proteins

图4 靶点与靶点之间相互作用图Fig.4 Interaction diagram between target and target

表2 关键靶点信息Tab.2 Information of key targes

续表2

2.5 靶点通路分析 将35个关键靶点通过DAVID数据库进行GO功能富集分析，得到1 519个条目（P＜0.1），包括1 075个生物学过程、230个细胞组分、214个分子功能（筛选degree前20的条目绘制柱状图），可以看出苏格木勒-10复方治疗肾病综合征的主要靶点显著富集在细胞代谢过程的正调控、细胞对化学刺激和外部刺激的反应、防御、对内源性刺激的反应、分子功能的调节等生物过程（BP）。从细胞组分（CC）的富集结果可见，主要参与的有细胞质、细胞器、细胞内膜等；从分子功能（MF）主要富集结果可以看出，苏格木勒-10防治肾病综合征主要表现为蛋白质结合、催化活性、受体结合、水解酶活性、酶结合、受体配体活性、信号转导活动、分子转导活性等。

通过DAVID数据库对交集靶点进行通路（KEGG）分析，以P＜0.005为条件，共筛选出17条信号通路，应用Omicshare对17条通路富集分析，结果见表3、图5。表3显示了前几条重要通路，图5的气泡图是根据P值的大小进行排列的，P值越小表示该路径与疾病的相关性越强，可以看到癌症信号通路（Pathways in cancer）、癌症中的蛋白聚糖通路（Proteoglycans in cancer）、类风湿关节炎信号通路（Rheumatoid arthritis）、恰加斯病（美国锥虫病）（Chagas disease（American trypanosomiasis））、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、百日咳（Pertussis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD））、疟疾（Malaria）、结核（Tuberculosis）、肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system）、NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、肾素分泌（Renin secretion）等通路参与肾病综合征的病理改变。由此可知，苏格木勒-10化合物相关靶点是同时作用于不同的路径来防治肾病综合征。

表3 KEGG通路富集重要路径Tab.3 Important pathways in KEGG pathway enrichment

图5 KEGG通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis

3 讨论

本研究通过在TCMSP数据库中以药物口服生物利用度≥20%、类药性≥0.1为筛选条件，筛选出符合条件的126个化合物，其中与关键靶点连接拓扑学分析中Degree值高的亮氨酸、亚麻酸、油酸通过口服补充可以对类风湿性关节炎、前列腺炎、特异性皮炎起到一定的治疗和预防效果，也可促进乳腺癌、前列腺癌细胞的凋亡，降血脂、血压［15-18］；姜黄素、胡椒碱具有治疗炎症、风湿、代谢紊乱等作用［19-21］。现代药理学研究表明，其君药苏格木勒具有抗氧化应激及改善肾脏病理功能［22-25］、利尿和抗利尿作用［26］，生姜提取物（10-DHGD）具有抗炎及减轻肾脏纤维化作用［27］。莲子［28］降低糖尿病鼠的血糖。通过cytoscape对潜在作用靶点得到的蛋白相互作用信息进行拓扑学分析，筛选出关键靶点35个，靶点间通过394条相互作用协同影响疾病的防治。

通过35个交集靶点的GO分析可知，BP、CC、MF等生物过程贯穿于药物治疗疾病的整个作用机制中，表明苏格木勒-10可通过调控多个生物学过程来发挥防治肾病综合征的作用。

KEGG富集结果表明，关键靶点主要富集于癌症、类风湿关节炎、肾素-血管紧张素系统、肾素分泌、TNF信号、NOD样受体等信号通路，表明苏格木勒-10可通过作用于不同的通路来防治肾病综合征。其中，TNF信号通路、肾素-血管紧张素系统、肾素分泌、NOD样受体信号通路在肾小球疾病的防治过程中起重要作用。肾小球疾病尽管有非免疫因素的参与，但大多数被认为是免疫介导的炎症性疾病，免疫反应常为肾小球疾病的始发机制。NOD2是一种胞质受体，根据报道发现，外源微生物如细菌胞壁肽聚糖等可通过NOD2途径激活核因子-κB、MAPK和半胱氨酸天冬氨酸酶-1途径启动促炎因子如TNF-α、白细胞介素以及各种抗微生物因子，继而激活机体的先天性免疫反应［29］，从而保护机体避免受过度炎症的损伤。NS的水肿是与肾小球滤过率降低，肾小管重吸收增加，肾素-血管紧张素系统（RAS）、抗利尿激素分泌增加相关。RAS通过维持肾动脉血管压力、调整血压，平衡体液和钠离子、钾离子等电解质及细胞对大分子物质的摄入而影响免疫复合物沉着［30］，进而影响肾脏的生理功能，在肾脏病的发生、发展中具有重要作用。根据相关研究发现［31］，TNF-α是与慢性肾脏病发病机制密切相关的细胞因子之一，通过改变内皮细胞黏附力刺激成纤维细胞增生，促进纤维化。TNF等炎症因子同时也是糖尿病肾病发生与发展的主要因素。

综上所述，本研究首次借助网络药理学方法，初步探讨了苏格木勒-10复方防治肾病综合征的活性成分及可能作用机制，发现其化合物在炎症防御方面疗效显著，且主要作用于炎症通路、癌症通路、肾素-血管紧张素系统，这些发现为苏格木勒-10后续进一步研究提供了思路及理论依据。