7 种植物精油对2 种苹果病害病原菌的抑菌活性*

张 坤，张鹏九，高 越，刘中芳，杨 静，樊建斌，赵劲宇，范仁俊

（山西农业大学植物保护学院，山西省农业科学院植物保护研究所，农业有害生物综合治理山西省重点实验室，太原 030031）

目前苹果树病害的防治措施主要为化学防治，由于化学农药的频繁使用，导致了土壤化学农药的高残留、果树上耐药性菌株的出现等一系列生态环境问题，这些因素严重限制了化学农药的使用和苹果产业的发展[1-2]。

按发病部位来划分，苹果树病害可分为果实病害、枝干病害、叶片病害，其中，由于目前果园大多采用套袋技术，果实病害大大减少[3]。苹果枝干病害分为苹果树腐烂病、苹果干腐病和苹果轮纹病，其中苹果树腐烂病是苹果树的重要病害，病原菌为黑腐皮壳菌（Valsa mali），枝干被侵染后，引起树势衰弱甚至整株死亡，在发病初期，常使用甲基硫菌灵可湿性粉剂防治[4]。叶片病害，苹果斑点落叶病以发病早、传播快、侵染后快速造成叶片早落，严重影响树势和产量为特点，成为苹果七大落叶病（苹果斑点落叶病、苹果黑斑病、苹果炭疽叶枯病、苹果锈病、苹果灰斑病、苹果轮斑病、苹果圆斑病）中最为典型易发的病害[5]，病原菌为链格孢苹果专化型菌（Alternaria alternataf.sp.mali），在发病早期常使用戊唑醇微乳剂喷雾杀菌[6-7]。

植物精油作为一种植物源物质，是存在于植物中不同部位的一类相对分子质量较小、可随水蒸气蒸馏出来而又与水不相混溶的油状成分的总称[8]，是植物的次生代谢产物[9]。植物精油在自然界中分布广泛，化学成分繁多，主要有萜类化合物、酸性化合物（如苯甲酸）、醇类化合物（如香叶醇、薄荷醇）、醛类化合物（如柠檬醛、肉桂醛）、酮体以及酚类等，其中萜烯类、萜类和芳香酚类化合物在精油活性中起重要作用，而醛类的抗真菌活性最高[10-11]。截至目前，已有多篇文献研究报道了陈皮精油、松树油、薄荷精油、柠檬精油、桉叶油、青蒿精油、生姜精油具有一定的抗菌活性[12-20]，而关于这7 种精油对上述2 种病原菌的抑菌活性以及精油对化学杀菌剂的药量和药效的影响却鲜有报道。因此，我们选取苹果树上具代表性的2 种病菌作为供试病原菌，研究上述已被证实具有抑菌性的7 种植物精油对其的抑菌活性，同时在室内条件下研究了7 种植物精油对甲基硫菌灵和戊唑醇用药量和药效的影响，旨在为开发绿色植物源抑菌剂奠定基础，并为果树病害防治中农药减施增效提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验药剂

99%陈皮精油、99%松树油、99%薄荷精油、99%柠檬精油、99%青蒿精油、99%生姜精油、99%桉叶油等7 种供试精油均购自江西雪松天然药用油有限公司；无水乙醇、吐温-80 为市售化学纯；丙酮为市售分析纯；95%甲基硫菌灵原药，由陕西美邦农药有限公司提供；97%戊唑醇原药，购自山东华阳科技股份有限公司；超纯水为本实验室制备。

1.2 试验菌株和微生物培养基

苹果树腐烂病主要致病菌黑腐皮壳属病菌，苹果斑点落叶病主要致病菌链格孢苹果专化型菌，均由山西农业大学植物保护学院果蔬病害实验室提供。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）：马铃薯精粉6.00 g，葡萄糖20.00 g，琼脂20.00 g，称取本品46.00 g，加蒸馏水1 000 mL，115 ℃高压灭菌20 min，备用。

1.3 试验仪器设备

FA1604B 万分之一电子分析天平（上海精密仪器仪表有限公司），KQ-300E 超声波振荡器（上海五相仪器仪表有限公司），LDZH-150KBS 立式压力蒸汽灭菌锅（上海精密仪器仪表有限公司），ULUP-Ⅱ超滤除热源型超纯水器（西安优普仪器设备有限公司），ZHJH-C1112B 超净工作台（北京思博晟达科技有限公司），HWS-80 恒温恒湿培养箱（上海森信实验仪器有限公司）。

1.4 试验方法

（1）7 种供试精油的单剂抑菌活性[21]。将1 g样品用少许丙酮溶解后，配制成100 mg/mL 溶液备用，溶解过程中加入少许吐温-80，并在超声波振荡器上振荡5 min。用PDA 培养基梯度稀释母液，稀释至10、20、50、100、200、500 mg/L，倒入灭菌后的无菌培养皿中，待培养基冷却凝固后，迅速接入活化以后的待测菌种，每个处理设置3 个重复，空白对照为只加少许吐温-80 的等量丙酮。上述操作均在无菌操作台完成后，将培养皿用封口膜处理并置于25 ℃恒温培养箱中培养5 d，采用十字交叉法测量菌落的直径，根据菌丝生长速率法计算抑制率和抑制中浓度EC50。

（2）复配剂的抑菌活性。选择单独使用抑菌效果相对较好的精油单剂两两复配，通过预试验筛选不同精油复配比例，最佳配比为1∶1，故选择松树油、薄荷精油、陈皮精油、柠檬精油按体积比1∶1 进行复配，复配精油浓度梯度为10、20、50、100、200、500 mg/L，空白对照为只加少许吐温-80 的等量丙酮，按（1）步骤配制培养基，加入待测菌种培养，测量菌落的直径，根据Wadley 法计算复配剂的增效系数（SR）[22]。

（3）杀菌剂的抑菌活性。称取95%甲基硫菌灵、97%戊唑醇原药，分别用丙酮溶解配制成有效成分含量为1 000 mg/L 溶液备用，将溶液进行梯度稀释，根据一系列预试验结果，最终稀释液浓度梯度为0.25、0.50、1.25、2.50、5、10 mg/L，倒入灭菌后的无菌培养皿中。待培养基冷却凝固后，在加入甲基硫菌灵的培养皿中迅速接入活化以后的黑腐皮壳属病菌，在加入戊唑醇的培养皿中迅速接入活化以后的链格孢苹果专化型病菌，空白对照均为等量丙酮，其他步骤同（1）。

（4）精油单剂和农药混配后对农药抑菌性的影响。选择单独使用抑菌效果好的精油单剂备用，称取一定量原药溶解于丙酮和精油中，甲基硫菌灵原药和戊唑醇原药的使用浓度梯度均为0.25、0.50、1.25、2.50、5、10 mg/L，精油浓度为各自的抑制中浓度（EC50），配制成抑菌剂-精油混合溶液，对照组为（3）试验组，其他步骤同（3）。

（5）精油复配剂和农药混配后对农药抑菌性的影响。选择精油复配剂中抑菌效果好的柠檬-薄荷精油复配剂、柠檬-松树油复配剂、薄荷-松树油复配剂，分别加入到对应的抑菌剂溶液中，对照组为（3）试验组，其他步骤同（3）。

抑制率（%）＝［（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼初始直径）］×100

增效系数（SR）＝X1/X2，X1＝［（PA＋PB）×100］/（PA/A＋PB/B）

式中，X1 是混剂的EC50理论值；X2 为混剂EC50实测值；PA 为混剂中A 的百分含量；PB 为混剂中B 的百分含量；A 为混剂中A 的EC50值；B 为混剂中B 的EC50值。

SR≥1.50 表示具有增效作用；0.50＜SR＜1.50为相加作用；SR≤0.50 表示具有拮抗作用。

1.5 数据处理

运用Excel 2010、SPSS 17.0 软件对试验数据进行统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 7 种植物精油对黑腐皮壳菌和链格孢苹果专化型菌的抑制作用

由表1 可知，不同单剂对2 种病原菌抑制效果存在差异。7 种单剂均对黑腐皮壳菌具有抑制作用，其中陈皮精油、松树油、薄荷精油抑菌活性最好，EC50分别为123.37、157.12、193.13 mg/L；其次为柠檬精油和青蒿精油，EC50分别为219.31、294.97 mg/L；生姜精油和桉叶油的EC50分别为2 153.16、2 632.33 mg/L，其抑制黑腐皮壳菌的活性明显弱。

表1 7 种植物精油对黑腐皮壳菌和链格孢苹果专化型菌菌丝生长的抑制效果

7 种单剂中，对链格孢苹果专化型菌的抑制效果最好的是陈皮精油，EC50为148.13 mg/L，松树油和薄荷精油、柠檬精油次之，EC50在188～423 mg/L之间，青蒿精油、生姜精油、桉叶油未见抑制效果（表1）。

2.2 植物精油复配剂对黑腐皮壳菌和链格孢苹果专化型菌的抑制作用

由图1 可知，薄荷精油-松树油复配剂对苹果黑腐皮壳菌的抑制效果比二者单独使用时强，增效系数（SR）为2.30，表现增效作用，EC50为75.04 mg/L；柠檬精油-薄荷精油复配剂的抑菌效果也表现为增效作用，SR 为2.11，EC50为96.74 mg/L；其他精油复配剂的抑菌活性均较相应的单剂低，SR＜0.50，具有拮抗作用，EC50在239.25～725.51 mg/L 之间。

图1 精油复配剂对黑腐皮壳菌的抑制作用

由图2 可知，柠檬精油-松树油复配剂对链格孢苹果专化型菌的抑制效果较二者单独使用时要好，SR 为2.10，表现增效作用，EC50为122.02 mg/L；其他精油复配剂的抑菌效果均较相应的单剂差，SR＜0.50，表现为拮抗作用，EC50在122.02～589.66 mg/L 之间。

图2 精油复配剂对链格孢苹果专化型菌的抑制作用

2.3 不同植物精油单剂和复配剂对化学杀菌剂的减施增效作用

2.3.1 对甲基硫菌灵防治黑腐皮壳菌的减施增效作用

由图3-A 可知，甲基硫菌灵＋松树油对苹果黑腐皮壳菌的EC50为1.43 mg/L，较甲基硫菌灵单独使用时降低55.86%；甲基硫菌灵＋薄荷精油对苹果黑腐皮壳菌的EC50为1.55 mg/L，降低52.16%；甲基硫菌灵+陈皮精油对黑腐皮壳菌的EC50为1.60 mg/L，降低50.62%；甲基硫菌灵＋柠檬精油对苹果黑腐皮壳菌的EC50为2.35 mg/L，降低27.47%，甲基硫菌灵对黑腐皮壳菌的EC50为3.24 mg/L。

图3 精油单剂和复配剂对甲基硫菌灵抑制黑腐皮壳菌的作用

由图3-B 可知，薄荷精油和松树油复配剂与甲基硫菌灵混配后，对黑腐皮壳菌的抑菌活性较甲基硫菌灵单剂高，EC50为1.03 mg/L，较甲基硫菌灵单独使用时降低68.21%；柠檬精油和薄荷精油复配剂与甲基硫菌灵混配后，抑菌活性较甲基硫菌灵单剂要低，EC50为4.78 mg/L，较甲基硫菌灵单独使用时增高47.53%。

2.3.2 对戊唑醇防治链格孢苹果专化型菌的减施增效作用

由图4-A 可知，戊唑醇＋陈皮精油对链格孢苹果专化型菌的EC50为2.04 mg/L，较戊唑醇单独使用降低56.32%；戊唑醇＋松树油对链格孢苹果专化型菌的EC50为2.79 mg/L，降低40.26%；戊唑醇＋薄荷精油对链格孢苹果专化型菌的EC50为3.90 mg/L，降低16.49%；戊唑醇＋柠檬精油对链格孢苹果专化型菌的EC50为4.33 mg/L，降低7.28%，戊唑醇对链格孢苹果专化型菌菌丝生长的EC50为4.67 mg/L。

由图4-B 可知，松树油和柠檬精油复配剂与戊唑醇混配后，对链格孢苹果专化型菌的EC50为1.93 mg/L，较戊唑醇单独使用时降低58.68%。

图4 精油单剂和复配剂对戊唑醇抑制链格孢苹果专化型菌的作用

3 讨论与结论

本文研究了在室内条件下7 种植物精油对黑腐皮壳菌和链格孢苹果专化型菌的抑菌活性，同时研究了7 种精油对甲基硫菌灵防治苹果黑腐皮壳菌、戊唑醇防治链格孢苹果专化型菌的影响。结果表明，陈皮精油、松树油、薄荷精油、柠檬精油4 种精油单剂对黑腐皮壳菌和链格孢苹果专化型菌2 种病原菌均具有一定程度的抑制作用，青蒿精油仅明显抑制黑腐皮壳菌菌丝生长，而桉叶油与生姜精油对2 种病原菌均无明显的抑制效果。左春生等[23]发现桉叶油可明显抑制鸭疫里默氏菌，其最小抑菌浓度为78.12 μL/L。这与本研究结果存在不同，其原因可能是鸭疫里默氏菌是一种黄杆菌种，属于卵生类家禽细菌，而本研究中黑腐皮壳菌和链格孢苹果专化型菌均为半知菌亚门真菌[24]。鲁萌萌等[25]通过透射电镜发现生姜精油能延长细菌的生长停滞期，抑制细菌的生长速率，且能引起细菌细胞膜破损，致使胞内物质渗漏，从而抑制细菌活性。因此，桉叶油和生姜精油对细菌具有抑菌作用，而对果树病害真菌却无明显抑菌作用。而关于植物精油的抑菌机理，国内外也进行了相关研究，普遍认为精油中的抑菌成分抑制了病原菌菌丝生长以及孢子萌发，同时改变了细胞膜的渗透性和宿主抗病性，增加了细胞膜相对电导率，导致核酸、蛋白质和ATP 都发生丢失[26-27]。

本研究发现，与其单独使用相比，薄荷精油-松树油复配剂、薄荷精油-柠檬精油复配剂对黑腐皮壳菌的抑制作用增强，柠檬精油-松树油复配剂对链格孢苹果专化型菌的抑制作用增强。这与刘欢等[28]的研究结果相似，他们测试了精油有效成分肉桂醛/柠檬醛协同抑菌活性，发现精油复配以后使葡萄灰霉菌的细胞溶出物释放量和细胞膜渗透性显著增加，抑菌效果更强。

精油与甲基硫菌灵和戊唑醇2 种杀菌剂混配后，其中，陈皮精油、松树油、薄荷精油、柠檬精油的单剂均增强了甲基硫菌灵对苹果黑腐皮壳菌、戊唑醇对链格孢苹果专化型菌的抑菌能力。但精油复配剂与杀菌剂混配后，仅薄荷精油-松树油复配剂增强了甲基硫菌灵对苹果黑腐皮壳菌的抑菌能力，柠檬精油-松树油复配剂增强了戊唑醇对链格孢苹果专化型菌的抑菌能力。结合农药助剂的作用原理[29]，推测可能是精油增强了化学杀菌剂的渗透性和润湿性，使杀菌剂成分更快、更有效地进入病原菌细胞内，加快影响了苹果黑腐皮壳菌和链格孢苹果专化型菌细胞膜的通透性，甚至破坏了其磷脂双分子层；或者破坏了2 种菌的细胞膜，使内溶物和离子外流导致细胞死亡[30]；同时，也有可能精油与化学杀菌剂成分之间多点协同，破坏了2 种菌的胞内酶系统，阻碍了遗传物质的复制传递和微生物的繁殖，最终结果是抑制了它们的生长甚至导致死亡[31]。综上，陈皮精油、松树油、薄荷精油、柠檬精油不仅可以抑制2 种病原菌的生物活性，还对甲基硫菌灵和戊唑醇的抑菌性产生增效作用，具有成为绿色植物源杀菌剂和化学农药助剂的潜力。

本研究为植物精油在苹果树枝干、叶部病害的防治提供了新的思路，也为植物源杀菌剂和植物源农药助剂的开发提供了基础数据。但当下植物精油作为天然杀菌剂和农药助剂成分的应用仍然面临诸多问题，比如植物原材料提取精油效率不高[32]、提取后存放不恰当会见光分解造成浪费[33]、植物精油具有强烈挥发性[34]等，这些问题可以借鉴精油在食品行业中的应用原理从而得到解决，如优化精油的提取工艺、改良仪器设备，避免原材料浪费，提取后采用不透光密封罐储存，田间施用时采用壳聚糖膜包裹制成壳聚糖精油复合膜，从而延迟精油的释放[35-36]。

本试验通过室内测定发现，与精油混配后，甲基硫菌灵的使用量减少27.47%～68.21%，戊唑醇的使用量减少7.28%～58.68%，如果能应用到生产中，会改善生态环境。但是有关精油对杀菌剂的增效机制还有待进一步研究，下一步将探明机制并将筛选出来的精油开发成植物源农药助剂产品，应用到果园生产中。