酿酒葡萄马瑟兰与小味尔多果实中酚类物质积累的比较分析*

王岩璞，单守明，李 萍，韦 伟，金 悦

（宁夏大学农学院，银川 750021）

酿酒葡萄果实中主要酚类物质按照化学结构可以分为类黄酮和非类黄酮2 大类，类黄酮主要包括花色苷、黄烷醇、黄酮醇等，非类黄酮主要包括酚酸、白藜芦醇等物质[1]，这些酚类物质广泛分布于果皮、果肉和种子中，它们不但参与葡萄果实中各种代谢活动，而且影响葡萄酒的口感、色泽和颜色稳定性，对葡萄酒的许多感官品质（色泽、风味、澄清度）具有决定性作用，它还具有很强的抗氧化活性，是葡萄和葡萄酒中重要的保健功能成分[2-7]。葡萄果实中酚类物质代谢是多基因控制的数量性状，结构基因和调节基因共同参与酚类物质的合成，品种、砧木、环境条件、胁迫、植物生长调节剂、成熟度和栽培措施等条件可在转录或转录后水平调节葡萄果实中这些基因的表达和酶活性，最终影响酚类物质的种类和含量[8-9]。研究发现[10]，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、类黄酮3′-羟化酶（F3′H）、类黄酮3′,5′-羟化酶（F3′5′H）和类黄酮3-O-葡糖基转移酶（UFGT）都是苯丙烷代谢途径及类黄酮代谢途径中酚类物质合成的部分关键酶。宁夏贺兰山东麓独特的环境条件使其成为我国酿酒葡萄优质生态产区之一[11]，随着贺兰山东麓酿酒葡萄产业的发展、栽培的品种也出现区域化和多样化的发展趋势，在现有赤霞珠、梅鹿辄、蛇龙珠、西拉等品种的基础上，已开始栽培马瑟兰、小味尔多等酿酒葡萄品种，以实现葡萄酒的多样化发展和提高经济效益。

经前人对成熟期酿酒葡萄果实类黄酮和香气物质组成和含量的测定发现[12]，马瑟兰中黄酮醇、黄烷醇和结合态萜烯含量较高，小味尔多游离态和结合态降异戊二烯类、游离态醛酮类香气含量较高，2 个品种都具有种植潜力，但是并未比较2 个品种谁更突出。为此，笔者以马瑟兰、小味尔多为试材，通过对其果实中酚类物质积累及其PAL、C4H、F3′H、F3′5′H和UFGT基因相对表达量的比较，为马瑟兰、小味尔多2 个葡萄品种提供种植理论依据和技术指导，旨在为宁夏贺兰山东麓优质酿酒葡萄品种选择提供更多的参考依据，以丰富宁夏产区酿酒葡萄种植品种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在宁夏贺兰山东麓的“宁夏现代农业综合开发工程技术研究中心”酿酒葡萄试验园进行。以5 年生红色酿酒葡萄品种马瑟兰（Vitis viniferaL.cv.Marselan）和小味尔多（Vitis viniferaL.cv.Petit Verdot）为试材（自根苗），南北行向栽植，行株距3.0 m×0.8 m，“厂”字形树形，叶幕高1.5 m，常规管理。试验采用随机区组重复3 次的设计方案，每个处理选择生长势相对一致且无病虫害的葡萄树30 株，负载量基本一致，分别于果实膨大期（花后45 d）、转色前期（花后70 d）、完全转色期（花后95 d）及采收期（花后120 d）采集各处理果实样品，液氮速冻后贮于-84 ℃超低温冰箱中用于生理指标、酚类物质含量及其合成关键酶基因的相对表达量的测定。

1.2 试验方法

1.2.1 酚类物质的测定

取2.0 g 样品于三角瓶中，加入5 mL 蒸馏水和45 mL 乙酸乙酯，避光振荡30 min，收集上清液，重提3 次，合并上清液于圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪蒸干（33 ℃，避光），2 mL 色谱甲醇定容，0.45 μm 的滤膜过滤后备用。采用岛津LC-20A 高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）进行测定，C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 mm），流动相A：2%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL，检测波长280 nm。根据标准样品的出峰时间来确定样品中单体酚的成分，通过标准曲线来定量[13]。

1.2.2 果实品质的测定

采用蒽酮硫酸比色法测定采收期果实中可溶性糖含量，采用NaOH 滴定法测定可滴定酸含量，采用福林-肖卡法测定单宁含量，采用福林酚法测定总酚含量，采用比色法测定花色苷含量[14]。

1.2.3 总RNA 的提取及荧光定量PCR

用多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒（TIANGEN）提取果实的总RNA。以总RNA 为模板，用Takara PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒进行反转录。内参基因为VvEF，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、类黄酮3′-羟化酶（F3′H）、类黄酮3′,5′-羟化酶（F3′5′H）、类黄酮3-O-葡糖基转移酶（UFGT）的引物序列如表1。PCR 反应体系为1 μL的cDNA（模板浓度200 ng/μL），上、下游引物各0.5 μL，12.5 μL 的2×UltraSYBR Mixture（CWBIO），10.5 μL 的ddH2O，试验结果采用2-△△CT进行相对定量计算[15]。

表1 荧光定量PCR 引物序列

1.3 数据处理与分析

使用SPSS 23.0 和Excel 2010 进行数据统计分析，用Origin 2018 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 2 个品种果实中酚类物质含量比较

从图1 可以看出，马瑟兰与小味尔多果实中酚酸类物质随着果实的发育不断下降，花后95 d 达到最小值，极显著低于其他时期。在花后45 d 和70 d时，小味尔多果实中酚酸类物质含量均极显著高于马瑟兰；在花后95 d 和120 d 时，马瑟兰果实中酚酸类物质含量均极显著高于小味尔多。

图1 不同发育期马瑟兰与小味尔多酚类物质含量比较

随着果实的发育，2 个品种果实中的黄烷醇与黄酮醇类物质含量不断升高，分别在花后70 d 和花后95 d 时达到最高值，之后开始下降。在花后45 d和70 d 时，小味尔多果实中黄烷醇类物质含量均极显著高于马瑟兰，在果实采收期，二者间黄烷醇含量无显著差异（图1）。

白藜芦醇含量随着果实发育总体呈上升趋势，花后70 d 时为第1 个积累高峰，马瑟兰增长速率最快，为98.35%。花后120 d 时，白藜芦醇含量迅速积累，其含量在5.87～9.70 mg/kg 之间，极显著高于其他时期。在花后70 d 和120 d，马瑟兰果实中白藜芦醇含量均极显著高于小味尔多（图1）。

采收期马瑟兰与小味尔多果实中酚酸类物质总含量无显著差异（表2）。在6 种酚酸类物质中，以没食子酸含量最高，占酚酸总含量的35.6%～66.2%；绿原酸含量最低，占酚酸总含量的3.2%～5.1%。马瑟兰果实中咖啡酸、绿原酸、苯甲酸和水杨酸含量比小味尔多高70.3%～199.2%，差异达到极显著水平；但是没食子酸含量比小味尔多低43.1%，差异也达到极显著水平。

表2 马瑟兰与小味尔多采收期果实中酚类物质含量

黄烷醇类物质是果实中含量比例最高的一类酚类物质（表2）。在所测4 种黄烷醇类物质中，以儿茶素含量最高，占黄烷醇类物质总含量的62.2%～80.7%；表没食子儿茶素没食子酸酯含量最低，占马瑟兰果实中黄烷醇类物质总含量的4.1%左右。马瑟兰果实中儿茶素和表儿茶素分别比小味尔多低19.0%和32.5%，差异达到极显著水平。在小味尔多果实中儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯含量均较低。

马瑟兰和小味尔多果实中黄酮醇类物质总含量分别占总酚类物质含量的5.8%和10.2%（表2）。在6 种黄酮醇类物质中，以芦丁含量最高，占黄酮醇类物质总含量的76.2%～87.6%；马瑟兰果实中桑色素含量最低，占黄酮醇类总含量的0.1%，小味尔多果实中山奈酚含量最低，占黄酮醇类总含量的0.2%左右。马瑟兰果实中槲皮素、山奈酚、白藜芦醇物质含量分别比小味尔多高88.5%、232.1%和65.2%，而芦丁、柚皮苷和桑色素分别比小味尔多低50.5%、45.5%和95.5%，差异均达到极显著水平。

对采收期马瑟兰与小味尔多果实中17 种酚类物质成分进行主成分分析，结果如图2、图3 所示，第一主成分的贡献率为95.7%，第二主成分的贡献率为4.0%，累计贡献率为99.7%。由载荷图可知：咖啡酸（1）、苯甲酸（4）、水杨酸（6）、表没食子儿茶素没食子酸酯（9）、儿茶素没食子酸酯（10）、山奈酚（16）、白藜芦醇（17）位于第一象限，与PC1和PC2 呈正相关。而没食子酸（5）、儿茶素（7）、表儿茶素（8）、芦丁（11）、柚皮苷（12）、桑色素（14）与PC1 和PC2 呈负相关。绿原酸（2）、阿魏酸（3）、杨梅素（13）、槲皮素（15）位于第四象限，与PC1 呈正相关，与PC2 呈负相关。结合图2 和图3 可知，马瑟兰的特征酚类物质为高含量的咖啡酸（1）、苯甲酸（4）、表没食子儿茶素没食子酸酯（9）、儿茶素没食子酸酯（10）、白藜芦醇（17），小味尔多果实中特征酚类物质为高含量的没食子酸（5）、儿茶素（7）、表儿茶素（8）和芦丁（11）。

图2 马瑟兰与小味尔多成熟期果实单体酚组分主成分得分图

图3 马瑟兰与小味尔多采收期果实单体酚组分主成分载荷图

2.2 2 个品种酚类物质合成关键酶基因相对表达量的比较

对苯丙烷代谢途径及类黄酮代谢途径中酚类物质合成的部分关键基因表达进行检测，结果如图4 所示。在整个转色期小味尔多的VvPAL保持较高表达水平，转色前期马瑟兰的VvPAL表达极显著低于小味尔多；随着果实转色，VvPAL上调表达，完全转色期（花后95 d）二者无显著差异。随后VvPAL基因表达量下降，采收期马瑟兰VvPAL相对表达量极显著高于小味尔多。

由图4 可知，随着果实转色，马瑟兰和小味尔多果实中VvC4H基因表达量不断升高，完全转色期小味尔多果实中VvC4H相对表达量极显著高于其他时期，采收期马瑟兰VvC4H表达量极显著高于其他时期。在果实发育各个时期，小味尔多果实中VvF3′H基因保持较高表达水平，除完全转色期外均极显著高于相同时期的马瑟兰。完全转色期马瑟兰果实中VvF3′H的相对表达量最高，极显著高于转色前期。

图4 不同发育期马瑟兰与小味尔多酚类物质合成关键酶基因相对表达量比较

马瑟兰果实中VvF3′5′H的相对表达量在转色前期和完全转色期很高，均极显著高于采收期；在转色前期和完全转色期也均极显著高于小味尔多。在果实采收期，小味尔多果实中VvF3′5′H的相对表达量极显著高于马瑟兰，也极显著高于小味尔多其他时期（图4）。

马瑟兰与小味尔多果实中VvUFGT基因相对表达量的变化规律一致，在完全转色期其相对表达量最高，此时小味尔多果实中VvUFGT相对表达量极显著高于其他时期，也极显著高于马瑟兰。马瑟兰果实中VvUFGT相对表达量在转色前期和完全转色期无显著差异，均极显著高于采收期（图4）。

2.3 2 个品种果实品质的比较

在果实采收期，马瑟兰果实的平均单果重比小味尔多低20.1%，差异达到极显著水平；其果实中可溶性糖、可滴定酸含量分别比小味尔多高4.8%和3.2%，但差异不显著。马瑟兰果实中花色苷含量比小味尔多高19.6%，差异显著；但是其果实中单宁、总酚含量分别比小味尔多低75.0%和24.3%，差异均达到极显著水平（表3）。

表3 马瑟兰与小味尔多的果实品质

3 讨论与结论

果实中酚类物质是葡萄酒中酚类物质的主要来源，酚类物质的组成和含量影响葡萄酒的口感、色泽和稳定性，对葡萄酒的保健品质指标也具有决定性作用[2-6]。王瑜等[7]研究发现，马瑟兰果皮中单宁和总酚含量低于蛇龙珠，但是五大类花色苷总含量显著高于蛇龙珠。本研究结果表明，在采收期马瑟兰和小味尔多果实中酚酸类和黄烷醇类物质总含量无显著差异，但是马瑟兰果实中白藜芦醇含量极显著高于小味尔多，其黄酮醇类物质总含量极显著低于小味尔多。这表明，品种间基因型不同是果实中各种酚类物质积累差异产生的主要原因[16]。

主成分分析法广泛应用在果实品质评价和新品种引选等方面[17]，本研究通过将采收期马瑟兰和小味尔多果实中17 种酚类物质进行主成分分析，结果表明，马瑟兰果实中特征的酚类物质是高含量的咖啡酸、苯甲酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯和白藜芦醇，小味尔多果实中特征酚类物质是高含量的没食子酸、儿茶素和表儿茶素以及芦丁。小味尔多果实的单宁和总酚含量均极显著高于马瑟兰，这说明，马瑟兰果实中酚类物质均衡，花色苷含量高，小味尔多果实中酚类物质特征更突出，单宁高，收敛性更强。

PAL 是葡萄果实中酚类物质合成的第一个关键酶，调节酿酒葡萄果实中VvPAL、VvC4H等基因的表达和酶活性，可显著提高采收时果实中酚类物质的含量和组成[18-21]。本研究结果表明，在果实采收期，马瑟兰果实中这些基因的相对表达量均极显著高于小味尔多，果实中咖啡酸、白藜芦醇含量也均极显著高于小味尔多，阿魏酸和总花色苷含量均显著高于小味尔多，这表明这些基因的相对表达量与相关酚类物质的积累基本一致。刘思凡等对6 个欧山种红色酿酒葡萄品种果实成熟期进行单体酚含量和基因相对表达量测定，发现酚类物质的种类和含量在不同葡萄品种间呈显著差异，这主要与葡萄果实中酚类合成基因的调控有关，且花色苷和酚类物质受VvPAL、VvC4H、VvF3′H、VvF3′5′H等基因调控[10]。

葡萄中柚皮素等上游酚类物质在F3′H、F3′5′H等酶的作用下逐步合成二氢黄酮醇类物质，随后在UFGT 等酶的作用下形成稳定的花色苷，环境、栽培条件、植物生长调节剂等调节这些基因的表达，也能提高没食子酸等酚酸类和表儿茶素、芦丁、桑色素等黄酮类物质的含量[22-24]。本研究结果表明，在转色前期，小味尔多果实中VvPAL、VvF3′H基因的相对表达量均一直处于高水平，且显著高于马瑟兰，在采收期小味尔多VvF3′H、VvF3′5′H、VvUFGT表达量均极显著高于马瑟兰，在采收期，小味尔多果实中单宁、总酚、没食子酸、儿茶素和芦丁均极显著高于马瑟兰，这表明调节VvF3′H、VvF3′5′H、VvUFGT等基因表达也可显著影响小味尔多果实中单宁、总酚和花色苷的含量。这与乔子纯等[25]的研究结果相似。因此，酚类物质合成关键酶基因的时空差异表达可造成马瑟兰与小味尔多果实中酚类物质组成和含量的显著差异。2 个葡萄品种都适合宁夏产区栽培，在果实采收期，酚类物质的积累小味尔多优于马瑟兰。