谷胱甘肽对铅胁迫下辣椒幼苗生理特性的影响

雷 阳，乔 宁，苗如意，杨玉花，吴越莉

（1.山西农业大学园艺学院 太原 030031； 2.农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室·山西农业大学农业基因与资源研究中心 太原 030031）

重金属铅（Pb）是植物体内的非必需元素，可造成植物细胞内活性氧（ROS）过量积累，进而导致植物生长迟滞、光合作用受阻，甚至细胞死亡等严重的生理胁迫。随着我国工业化和城市化的持续发展，工矿企业排放的三废、汽车尾气中的铅离子大量进入土壤和地下水中。据统计，我国土壤中的铅等重金属污染情况极其严重，污染超标率高达7.0%，而其中工业园区和矿区的土壤污染最为严重，超标率分别高达29.4%和33.4%。山西省经济发展长期依赖重工业和矿产资源，土壤中的铅污染严重，已经成为经济转型、农业绿色发展的限制性因素。

谷胱甘肽（GSH）是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的多肽类活性小分子，一方面可直接或间接清除ROS，同时也能够通过形成多聚物进而螯合铅等重金属离子，降低重金属的胁迫危害。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是合成GSH 前体的关键酶，其活力直接决定了GSH 合成速率，丁硫堇（BSO）是γ-GCS 的抑制剂，能够有效减少植物内源GSH 含量。Estrella-gómez 等研究表明，小槐叶可通过激活基因的表达来增加谷氨酰胺合成酶（GS）合成量，进而提高GSH 含量来应对铅胁迫对细胞的损害。Nahar 等研究表明，GSH 可有效提高干旱胁迫下绿豆的生物量、光合色素含量、抗氧化物酶活性，有效缓解干旱胁迫对绿豆幼苗生长的抑制作用。Zhou 等的研究表明，GSH 可有效缓解盐胁迫对番茄光合作用的抑制，并提高抗氧化物酶活性，而添加BSO 则会起到与GSH 相反的作用。

近年来，随着我国铅污染的情况不断恶化，科研工作者做了大量关于缓解植物铅胁迫的研究。然而，关于GSH 对铅胁迫下辣椒生理影响的研究尚未见报道。笔者针对山西省土壤的铅污染问题，探究了铅胁迫下不同浓度GSH 和1 mmol·LBSO对辣椒幼苗各项生理指标的影响，旨在探讨GSH 对辣椒逆境响应的调节机制，以期为辣椒耐重金属栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试辣椒品种为晋椒503，由山西农业大学园艺学院辣椒育种团队提供。铅离子供体Pb（NO）和谷胱甘肽GSH 均购自Sigma 公司，BSO 购自北京百灵威科技有限公司。

1.2 方法

试验于2020 年3 月在山西农业大学（龙城校区）进行。选取均匀无病害的晋椒503 辣椒种子，用灭菌水在室温下浸泡4～5 h。然后用75%乙醇冲洗20 s，15%NaClO 冲洗15 min，灭菌水洗涤3 次，放入真空干燥箱40 ℃烘干30 min，播种于72 孔的穴盘中，25 ℃（光/暗12 h/12 h）光照培养箱中培养。培养15 d 后，取长势一致的幼苗，分成CK 对照组和5 个处理组移栽至营养箱中，土壤营养液于处理时直接加入，GSH 和BSO 以叶片喷施的方式于每日08：00 进行喷施，详见表1。在处理12 d 后测定根长、株高、地上/地下部干质量、根冠比等指标，每处理测定3 株，3 次重复。将收集的辣椒幼苗从根部和茎部切开，分别于105 ℃杀青15 min，80 ℃烘干至质量恒定，分别称量地上部和地下部干质量，地下部干质量与地上部干质量之比即为根冠比。

表1 试验处理

1.3 幼苗生理指标的测定及方法

叶绿素a、b 和类胡萝卜素含量的测定：避光条件下取晋椒503 辣椒幼苗叶片2 g，采用丙酮溶解法提取，然后分别在470、649 和665 nm 波长下测定。

采用Murshed 等的方法测定AsA（抗坏血酸）、脱氢抗坏血酸（DHA）、GSH（谷胱甘肽）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量以及超氧阴离子（O）产生速率和HO含量。采用苏州格锐思生物技术有限公司试剂盒测定过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、谷胱甘肽还原酶（GR）和γ-GCS 酶活性。

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2016 整理数据和作图；采用SAS 1.2 分析数据，用Duncan 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 谷胱甘肽对铅胁迫下辣椒幼苗生物量的的影响

由表2 可知，与CK 相比，Pb 处理后辣椒幼苗根长、株高、地上部和地下部干质量以及根冠比均显著下降，降幅分别为30.83%、18.93%、32.99%、59.00%、38.24%。在铅胁迫下，4 个喷施GSH 处理比Pb 处理幼苗根长、株高、地上部和地下部干质量以及根冠比均显著提高；除根冠比外，喷施5、10、15 mmol·LGSH 对辣椒幼苗生物量均显著高于1 mmol·L的GSH 处理，而3 个高浓度GSH 处理之间幼苗生物量差异均不显著。与Pb 处理相比，PbBSO 则会显著降低辣椒幼苗根长、株高、地下部干质量，降低地上部干质量、根冠比。结果表明，GSH 可有效缓解铅胁迫对辣椒幼苗的毒害，促进辣椒幼苗生物量的增加，但仍比CK 有显著降低，未能恢复至CK 的水平。

表2 GSH 对铅胁迫下辣椒幼苗生物量的影响

2.2 GSH 对铅胁迫下辣椒幼苗叶片光合色素含量的影响

由表3 可知，与CK 相比，Pb 处理的叶片叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均显著降低，降幅分别为为46.83%、40.71%和49.17%。在铅离子胁迫下，4 个喷施GSH 处理与Pb 处理相比，辣椒幼苗叶片的叶绿素a 含量分别显著提高12.65%、49.38%、47.18%和49.90%，叶绿素b 含量分别显著提高33.20%、51.45%、54.15%和49.38%，类胡萝卜素分别显著提高18.75%、54.32%、62.20%和51.04%；其中PbGSH5、PbGSH10 和PbGSH15 光合色素含量均显著高于PbGSH1，而前3 者之间差异均不显著。与其他处理相比，喷施BSO 则会显著降低辣椒幼苗叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量和叶绿素a+叶绿素b 的含量。表明GSH 可有效缓解铅离子对辣椒光合色素的破坏，从而提升幼苗对铅胁迫的耐受性。

表3 GSH 对铅胁迫下辣椒幼苗光合色素的影响

2.3 GSH 对铅胁迫下辣椒幼苗叶片抗氧化物酶活性的影响

由图1 可知，与CK 相比，Pb 处理的叶片CAT、APX、POD 和SOD 活性均显著降低，降幅分别为44.28%、46.89%、46.94%和36.09%。在铅胁迫下，与Pb 处理相比，外源GSH 对辣椒叶片中的抗氧化物酶活性均有显著提高。其中，PbGSH5 处理的效果最为突出，其CAT 和POD 活性均显著高于其他GSH 处理，APX 和SOD 活性均显著高于PbGSH1和PbGSH15，但与PbGSH10 差异不显著。当GSH浓度达到15 mmol·L时，4 种抗氧化物酶活性均出现下降。与Pb 处理相比，铅胁迫下喷施BSO，则会显著降低POD 和SOD 活性，而CAT、APX 活性均与Pb 处理差异不显著。表明GSH 对抗氧化物酶活性的影响具有两面性，低浓度的GSH 可有效提升抗氧化物酶活性，而过高的浓度则会降低其活性。

图1 GSH 对铅胁迫下辣椒叶片抗氧化物酶活性的影响

2.4 GSH 对铅胁迫下辣椒幼苗叶片AsA-GSH 循环关键酶活性的影响

由图2 可知，与CK 相比，Pb 处理辣椒幼苗叶片MDHAR、DHAR、GR 和γ-GCS 活性均显著降低，降 幅 分 别 为29.43% 、34.47% 、46.40% 和38.60%。与Pb 处理相比，在铅胁迫下喷施GSH 可显著提高辣椒叶片MDHAR、DHAR、GR 活性，其中，PbGSH5 和PbGSH10 处理的效果较好，当GSH浓度达到15 mmol·L时，3 种酶的活性均比Pb-GSH10 处理显著降低；γ-GCS 活性则与其他3 种酶活性相反，与Pb 处理相比，在铅胁迫下喷施1 mmol·LGSH 时，辣椒幼苗叶片γ-GCS 活性略有提高，但与Pb 处理差异不显著；而当喷施其他浓度GSH 后反而会显著降低其活性，且喷施浓度越大，γ-GCS 活性越低。在铅胁迫下喷施BSO 后，MDHAR、GR 和γ-GCS 活性均比Pb 处理显著降低，降幅分别为8.81%、21.88%和63.42%。

图2 GSH 对铅胁迫下辣椒叶片AsA-GSH 循环关键酶活性的影响

2.5 GSH对铅胁迫下辣椒幼苗叶片AsA循环的影响

由图3 可知，Pb 处理比CK 处理的AsA 含量显著减低22.17%，DHA 含量显著升高53.21%，AsA/DHA 显著降低49.19%。与Pb 处理相比，在铅胁迫下4 种浓度GSH 处理均可显著提升辣椒叶片AsA 含量和AsA/DHA，并显著降低DHA 含量，且浓度越高效果越明显。其中，PbGSH15 处理的AsA 含量不仅比Pb 处理显著上升33.44%，且比CK 显著提高了3.86%。喷施BSO 后，与Pb 处理相比，辣椒叶片AsA 含量和AsA/DHA 均显著降低，DHA 含量显著升高。从正反两方面表明，GSH可缓解甚至逆转Pb 胁迫对辣椒AsA 循环的抑制作用。

图3 GSH 对铅胁迫下辣椒叶片AsA 循环的影响

2.6 GSH对铅胁迫下辣椒幼苗叶片GSH循环的影响

由图4 可知，与CK 相比，Pb 处理的辣椒叶片中GSH、GSSG 含量显著上升，增幅分别为25.85%、117.86%，同时GSH/GSS 显著降低了42.23%。与Pb 处理相比，在铅胁迫下喷施GSH 可不同程度地提高辣椒幼苗叶片中GSH、GSSG 含量和GSH/GSSG，其中PbGSH15 处理的效果最为突出，与Pb处理相比分别增加了182.21%、42.02%和98.71%。喷施GSH 合成抑制剂BSO 可显著降低GSH 含量和GSH/GSSG，与Pb 处理相比降幅分别为35.39%和31.77%，GSSG 含量比Pb 处理下降，且差异显著。

图4 GSH 对铅胁迫下辣椒叶片GSH 循环的影响

2.7 GSH对铅胁迫下辣椒幼苗叶片ROS的影响

由图5 可知，与CK 相比，Pb 处理辣椒叶片中O产生速率和HO质量摩尔浓度均显著升高，增幅分别为71.51%、64.22%。表明铅胁迫可显著升高辣椒幼苗叶片中ROS 含量。与Pb 处理相比，4 个喷施外源GSH 处理均可显著降低铅胁迫下的辣椒叶片中O产生速率和HO质量摩尔浓度，其中PbGSH15 处理的效果最为明显，与Pb 处理相比降幅分别为31.09%、30.30%，差异显著。喷施BSO 则会显著提升辣椒叶片O产生速率和HO质量摩尔浓度，分别比Pb 处理提高了37.16%和30.78%。正反两方面表明GSH 可有效提升辣椒幼苗清除体内ROS 的能力，缓解铅离子对辣椒叶片的氧化胁迫。

图5 GSH 对铅胁迫下辣椒叶片O2·-产生速率和H2O2含量的影响

3 讨论与结论

植物体内过量铅会造成细胞内的ROS 迅速积累，引起细胞膜过氧化，产生氧化胁迫，破坏光合色素稳定性，阻碍能量的正常转化，严重影响植物生物量的增长。本研究在铅胁迫下，辣椒幼苗的根长、株高、地上部和地下部干质量、叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素含量以及总叶绿素含量均显著下降，这与Zhou 等在番茄上的研究结果相一致。抗氧化物酶系统的关键酶有POD、CAT、SOD 和APX，O经由SOD 催化为HO，而HO可分别由POD 催化还原型辅酶代谢、APX 催化AsA 代谢，或者是CAT 直接清除。本研究在铅胁迫下，辣椒POD、CAT、SOD 和APX 活性均显著降低，在对铅胁迫下的辣椒幼苗喷施GSH 后，4 种抗氧化物酶活性均显著提高，但过高的GSH 浓度反而会一定程度降低它们的活性，这与邢春艳等的研究结果相一致。

GSH 在抗氧化剂系统中起到核心作用，GSH和AsA 可直接还原ROS，GSH 的氧化产物为GSSG，AsA 的氧化分为两步，分别生成单脱氢抗坏血酸（MDHA）和DHA；GR 可将GSSG 还原为GSH，实现GSH 的循环再生；以GSH 为电子供体，MDHAR 和DHAR 酶可分别将MDHA 和DHA 还原为AsA，实现AsA 的循环再生。本研究结果表明，在铅胁迫下，辣椒叶片中关键酶的活性、AsA 含量、AsA/DHA 和GSH/GSSG 均显著降低；GSH、GSSG 和DHA 含量显著升高。与Pb 处理相比，在铅胁迫下补充外源GSH 可显著提高GR、DHAR 和MDHAR 活性，从而提升AsA-GSH循环的还原态比例；而γ-GCS 活性则在喷施1 mmol·LGSH 时略有提高，但与Pb 处理差异不显著，之后随着GSH 浓度的增加而逐渐降低；添加BSO 可降低AsA-GSH 循环的关键酶活性以及还原态/氧化态比例。从正反两方面表明外源GSH 一方面可直接补充内源GSH，另一方面可通过激活AsA-GSH 循环系统关键酶活性来提升AsA-GSH的循环速率，加快清除铅离子引起的ROS 胁迫。同时本研究也表明在辣椒体内GSH 对γ-GCS 酶具有反馈抑制作用，这与前人的研究结果相一致。在正常状态下，O和HO等ROS 的生成和清除处于稳定的动态平衡。过量的铅离子会使平衡发生移动，在细胞内大量积累ROS，造成细胞氧化胁迫，影响植物的生长、发育、光合作用、逆境响应。本研究表明辣椒幼苗受到铅胁迫后O产生速率和HO含量上有显著升高，外源GSH 可有效降低ROS 含量，而BSO 则会加剧铅胁迫下ROS 的积累，这与蔡仕珍等的研究结果相一致。

本研究以铅胁迫下的晋椒503 幼苗为材料，探究了不同浓度GSH 和BSO 对辣椒幼苗各项生理生化参数的影响。结果表明，在铅胁迫下，外源喷施GSH 可以增加辣椒幼苗的生物量，增加叶片中光合色素含量，提高抗氧化物酶等的活性和AsA-GSH循环系统还原态/氧化态比例，进而清除O和HO等ROS；添加GSH 合成抑制剂BSO 则会逆转上述作用。综上所述，15 mmol·LGSH 可有效缓解铅胁迫对辣椒造成的生理损害，进而提高辣椒抵抗铅胁迫的能力。