耐盐溶磷菌YJC19的鉴定及不同培养条件对其溶磷效果的影响

谭海霞 李丽艳 王连龙 彭红丽 杜迎辉 孙杉杉

摘要：对前期从盐碱土壤中筛选到的1株溶磷菌株YJC19进行分子生物学鉴定，探讨分析菌株的耐盐特性及不同培养条件对其溶磷能力的影响，以期为其在盐碱地改良中的应用提供理论参考，为进一步开发耐盐溶磷微生物菌肥提供种质资源。通过形态观察和系统发育树分析对溶磷菌株进行鉴定，通过不同盐浓度PDA培养基对菌株生长影响判断其耐盐特性，采用钼锑抗比色法测定菌株YJC19在不同磷源[Ca 3（PO 4） 2、AlPO 4、FePO 4]、盐浓度（0、2.5%、5.5%、7.5%）、初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5）液体培养条件下的溶磷量。结果表明，菌株YJC19鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger），可耐受盐浓度高达15.0%，在盐浓度为0～7.5%培养基中生长良好。菌株YJC19具有较强的溶磷能力，对磷酸钙的溶解能力远大于磷酸铝和磷酸铁，溶磷量为1 741.59 mg/L;随着盐浓度的提高，菌株YJC19溶磷能力降低，2.5%盐浓度处理组的溶磷量与无盐对照组差异不显著。菌株YJC19在pH值5.5～8.5范围内均可正常生长，初始pH值为6.5时其溶磷量最高。不同环境条件的无机磷液体培养中，溶磷量与pH值均呈显著负相关，初步判断菌株YJC19溶磷机制为酸溶磷。菌株YJC19是1株耐盐碱性较强的高效溶磷真菌，为其应用于盐碱土改良提供了保证，可为北方盐碱土壤修复改良提供优质种质资源，具有良好的开发与应用潜力。

关键词：黑曲霉;耐盐溶磷菌;溶磷能力;培养条件;相关性分析

中图分类号：X171.4   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）09-0235-05

在农业生产中，磷肥施入土壤，约有80%的磷被土壤中铝、铁、钙等阳离子吸附固定，导致土壤中有效磷含量较低，磷已成为影响植物产量的养分限制因素之一[1]。化肥过量施用不利于农业可持续健康发展，研究表明，溶磷微生物可以活化土壤中的不溶性磷，进而促进植物生长，利用微生物提高土壤中磷的利用率已成为目前研究的热点[2-3]。目前已报道的多数溶磷菌都不耐盐碱，在高盐碱环境中溶磷能力有限，不适合在盐碱地施用。盐碱地的改良修复是亟需解决的问题，利用微生物改良盐碱土壤既节本增效，又可促进农业环境生态健康发展。本试验从河北滨海盐生植物根际土壤中筛选获得了1株高效溶磷耐盐真菌，对其耐盐能力及在不同培养环境溶磷特性进行初步分析，以期丰富盐碱地改良菌种资源库，为在盐碱地实际应用中提高盐渍土不溶性磷的利用效率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

试验于2021年3—5月在河北省农业生态安全重点实验室完成。试验菌株：解磷真菌YJC19（由领先生物农业股份有限公司微生物实验室从曹妃甸盐地碱蓬根际土壤中筛选分离得到）。

1.2 培养基

含盐PDA培养基：以马铃薯葡萄糖琼脂培养基[4]为基础，分别添加0、2.5%、5.5%、7.5%、10.0%、15.0% NaCl。

含盐无机磷液体培养基：在解磷液体培养基[5]的基础上添加2.5%、5.5%、7.5% NaCl。

1.3 溶磷菌的鉴定

1.3.1 形态学观察 参照文献[6-7]，对溶磷菌株 YJC19的菌落和分生孢子进行观察及鉴定。

1.3.2 菌株分子鉴定 参考文献[8]对溶磷菌株 YJC19进行基因组DNA提取并构建系统发育树。将测序得到的内源转录间隔区（ITS）序列在 NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中使用BLAST比对后，使用MEGA 6.0软件Clus-tral W 进行聚类分析，以 Neighbour-Joining 法构建分子系统发育树，结合形态鉴定，确定各菌株的亲缘关系及分类地位。

1.4 溶磷菌株YJC19耐盐能力探究

参考文献[9]测定菌株YJC19的耐盐能力，用接种环挑取菌株YJC19的菌丝1环于含盐PDA固体培养基中，30 ℃培养7 d，观察菌株生长情况。

1.5 不同培养条件对菌株YJC19溶磷能力的影响

分别改变原有无机磷培养基中磷源[Ca 3（PO 4） 2、AlPO 4、FePO 4]、盐浓度（2.5%、5.5%、7.5%）、初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5）等，在 100 mL 无机磷液体培养基中接种108 CFU/mL菌株YJC19孢子悬液1 mL，28 ℃、180 r/min 恒溫振荡培养 5 d[10]，每隔24 h取2 mL发酵液，测定上清液中有效磷的含量和pH值，以不接菌种处理为对照。

1.6 数据分析

采用Excel 2010、SPSS 25、Origin 8.0和MEGA 6.0软件进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 溶磷菌株YJC19分类学鉴定

2.1.1 形态学特征 菌株YJC19的菌落颜色先呈黄白后变黑。分生孢子梗长度不同，分生孢子头呈放射状，黑褐色，分生孢子呈褐色，球形。将纯化的菌株YJC19接种到无机磷固体培养基中，观察菌株的溶磷效果，如图1所示，培养5 d后，菌株YJC19周围的Ca 3（PO 4） 2已经明显被溶解并形成了透明的溶磷圈。

2.1.2 菌株分子鉴定 利用ITS通用引物ITS1和ITS4有效扩增出603 bp的片段。测序结果在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov上进行比较。利用BLAST软件构建系统发育树，利用Neighbour-Joining方法构建系统发育树。从图2可以看出，菌株YJC19与已报道的黑曲霉（Aspergillus niger）在分类学生态学中亲缘关系最密切，同源性较高。结合形态分析鉴定菌株YJC19为黑曲霉（A. niger） YJC19。

2.2 溶磷菌株YJC19的耐盐能力

培养7 d后，与对照组（无盐培养基）相比，盐含量为15.0%的培养基中，菌株YJC19有被抑制的趋势，长势较弱;盐含量为10.0%时，菌株可生长。可见，菌株YJC19可耐受高达15.0%的NaCl（表1）。目前研究的耐盐解磷菌主要为江红梅等筛选得到的草酸青霉M2，最高可耐受7%的盐浓度[4];范延辉等筛选的草酸青霉PSF2最高可耐受盐浓度阈值为12.5%[11];而本研究中菌株YJC19可耐受高达15.0%的盐浓度。菌株YJC19生长能力随盐胁迫的增加而降低，其原因可能是高盐浓度下细胞内Na+浓度较低，以此来免受毒害[12]，大量的能量用来调整自身的代谢途径以及适应环境，用于生长繁殖的能量相对减少，所以自身生长受到影响。

2.3 不同培养条件对其溶磷效果的影响

2.3.1 不同磷源對菌株YJC19溶磷能力的影响 由图3可知，菌株YJC19对3种磷酸盐的溶解能力总体表现为Ca 3（PO 4） 2>FePO 4>AlPO 4。培养 144 h，3种磷化合物培养液中有效磷含量均呈先升后降再趋于稳定的趋势。以Ca 3（PO 4）为磷源时，培养液中有效磷含量在48～72 h内快速增加，96 h时达到峰值（1 741.59 mg/L），此后平缓减少，同一培养时间内它的有效磷含量显著高于其他2种磷源。磷源为AlPO 4时，在72 h时有效磷含量最高（403.33 mg/L）;磷源为FePO 4时，在96 h时有效磷含量最高（693.75 mg/L）。

2.3.2 不同NaCl浓度对菌株YJC19溶磷能力的影响 在不同盐浓度的无机磷液体培养基中，菌株YJC19对磷酸三钙的溶解能力存在显著差异（P<0.05），总体表现为随着盐浓度的提高，菌株YJC19的溶磷能力降低。盐浓度为2.5%时，菌株YJC19溶磷能力仅次于对照组;盐浓度为7.5%时，溶磷能力最差。144 h培养期间，菌株YJC19对磷酸钙的溶磷量变化如图4所示，不同盐浓度对菌株YJC19溶磷能力的影响基本表现一致，溶磷量达到峰值的培养时间不同，盐浓度为2.5%和5.0%时溶磷量随培养时间的延长逐渐提高而后下降。盐浓度为2.5%时，前120 h溶磷量逐渐增加，120 h时达到峰值（1 719.48 mg/L）;盐浓度为5.0%时，96 h溶磷量达到峰值（790.83 mg/L）;盐浓度为7.5%时，溶磷量变化曲线呈“S”形，72 h时溶磷量达到峰值（497.08 mg/L），随后溶磷量略有降低再升高后趋于平稳趋势。

2.3.3 不同初始pH值对菌株YJC19溶磷能力的影响 如图5显示，菌株YJC19在pH值5.5～8.5范围内均可正常生长，但溶磷特性不同，处理组间差异极显著（P<0.01）。各处理组溶磷量出现峰值的时间不同，溶磷量峰值排序为6.5>7.5> 5.5>8.5。初始pH值为6.5时，溶磷量峰值达到 1 741.71 mg/L，分别比pH值为5.5、7.5、8.5处理组增加29.45%、9.38%、46.26%，表明培养菌株YJC19的培养基最适初始pH值为6.5。

2.4 菌株YJC19溶磷能力与pH值的关系

将菌株YJC19接种到不同环境条件的无机磷液体培养基中，总体来看，培养液的 pH值在培养144 h内均逐渐降低，在48～72 h迅速降低，均在120 h后逐渐平缓（图6）。不同磷源[Ca 3（PO 4） 2、AlPO 4、FePO 4）培养液在144 h内溶液pH值从7.0分别下降到2.33、3.96、3.02;不同盐浓度（2.5%、5.5%、7.5%）培养液在144 h内溶液pH值从7.0分别下降到2.65、3.56、3.98;不同初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5）培养液在144 h内溶液pH值分别下降到2.21、2.48、2.75、3.61。培养液pH值变化范围在2.0～8.5之间，在此范围内菌株均能正常生长，这表明菌株YJC19具有广泛的酸碱适应性。

对溶磷量与pH值数据进行Pearson相关性分析，不同环境的无机磷液体培养液中溶磷量与pH值两者均呈负相关（图7）。菌株YJC19在难溶磷源[Ca 3（PO 4） 2、AlPO 4、FePO 4]培养液中的溶磷量与pH值的相关系数分别为-0.886 （P<0.05）、-0.815 （P<0.05）、-0.903 （P<0.05）;不同盐浓度（2.5%、5.5%、7.5%）培养液中的溶磷量与pH值的相关系数分别为-0.976 （P<0.01）、-0.952 （P<0.01）、-0.829 （P<0.05）;不同初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5）培养液中的溶磷量与pH值的相关系数分别为-0.894 （P<0.05）、-0.812 （P<0.05）、-0.818 （P<0.05）、-0.978 （P<0.01）。这可能是因为YJC19菌体适应环境后，不断产生释放酸性代谢产物，随着溶磷量的增加，培养液pH值下降，这表明将菌株YJC19作为微生物菌剂应用于盐碱土中，不仅能增加盐碱土中可溶磷的含量，也可以改善盐碱土的酸碱环境。

3 结论与讨论

研究表明，溶磷真菌比溶磷细菌具有更高的溶磷能力[13]，从高盐环境中筛选分离得到的溶磷真菌主要局限于青霉属（Penicillium）[14]、曲霉属（Aspergillus）[15-16]等。本研究所用的菌株是1株从盐地碱蓬根际土中分离得到的溶磷真菌，鉴定为黑曲霉（A. niger），命名为YJC19。

研究表明，随着外界环境或营养物质的变化，溶磷菌的生长代谢会发生变化，导致菌株溶磷能力有明显差异[14，17]。在不同环境下菌株YJC19均具有溶磷能力，但溶磷效果有显著差异，它对磷酸钙（1 741.59 mg/L）的溶解能力显著高于磷酸铁（693.75 mg/L）和磷酸铝（403.33 mg/L），这与相关文献研究结论[18-20]一致。但与刘文干等的结论[21]不一致，其从红壤中筛选的黑曲霉菌株B1-A对磷酸盐溶磷能力排序为AlPO 4>Ca 3（PO 4） 2>FePO 4，这可能是由于北方盐碱土壤中难溶磷的主要形态为磷酸钙，强酸性红壤中以磷酸铝铁形态存在，微生物对土壤环境表现出高度的生理响应特性，进而不同菌株的溶磷机制不同，因此筛选土著溶磷菌具有重要意义。经过对菌株YJC19在不同NaCl浓度下的耐盐性和溶磷能力分析得知，菌株YJC19在 0～7.5% NaCl浓度范围内生长良好，溶磷量随着NaCl浓度的增加而减少。2.5%盐浓度处理组与无盐对照组无显著性差异，说明该菌有较强的耐盐性，为其在盐碱化土壤中的生长定殖提供了基本保障，提高盐碱地磷素利用率潜力巨大，但盐碱化程度高的土壤中该菌的溶磷能力降低。

pH值会影响微生物的生长和代谢。微生物溶解磷的方式多种多样，一般认为有机酸分泌是微生物溶解磷的主要途径[1]。王呈玉等研究发现，黑曲霉菌株An510的溶磷能力可能来自于有机酸的产生，发酵液中有机酸的含量和种类随培养时间和培养基质的不同而变化[8]。刘晓芳等研究发现，黑曲霉菌株ML4发酵液中含有多种有机酸[22]。本试验中菌株YJC19在初始pH值为5.5～8.5的培养液中均可正常生长，培养液中可溶磷含量基本表现为先升后降再趋于稳定的趋势，pH 值在培养 7 d内呈下降趋势，不同环境的无机磷液体培养中溶磷量与pH值均呈显著负相关，因此推测菌株YJC19的溶磷能力主要源自其分泌的有機酸物质，也可能与菌株代谢有关，其溶磷机制需进一步深入研究。

盐碱地改良是急需解决的问题，微生物改良盐碱地是一种环保、经济、高效的生物措施。本研究中的溶磷黑曲霉菌株YJC19兼具较强的耐盐性和溶磷能力，最高溶磷量可达1 741.59 mg/L，为其应用于盐碱土壤改良提供了保证，具有良好的开发与应用潜力。

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