荧光成像术中导航研究进展

张彩 叶兆祥*

癌症严重威胁人类生命，是亟需攻克的全球性健康难题，癌症病人的发病率和死亡率逐年上升。预计到2030 年，全球癌症的发病人数和死亡人数将分别达到2 170 万例和1 300 万例[1]。近年来，靶向治疗提高了癌症病人的生存率，但手术切除仍是大多数原发癌首选的治疗手段[2-3]。完全切除原发肿瘤与降低病灶复发率及提高病人的5 年生存率密切相关。尽管术前影像诊断技术已经非常完善，但术中判断肿瘤病灶范围仍然依赖于外科医生的视觉定位和触诊。此外，肿瘤与正常组织对比度较低，导致手术切缘的肿瘤阳性率增加, 小肿瘤被遗漏概率上升，而手术切缘肿瘤阳性的病人仍需进一步治疗，这将加重病人的经济负担[4]。影像引导术中导航有助于外科医生做出判断，降低手术切缘阳性率，已成为检测术中肿瘤范围的有效解决方法[5]。荧光成像术中导航基于对比剂在特定组织的富集，可精准显示术中血管、淋巴结、肿瘤组织等信息。光学分子影像技术可特异性可视化肿瘤组织中过度表达的特异性分子靶标，从而达到高信噪比肿瘤成像的效果，进一步降低手术切缘阳性率。本文就荧光术中导航发展现状、临床应用的荧光探针、分子荧光探针的制备和应用以及该技术目前的局限性和未来展望进行综述。

1 荧光成像术中导航

CT、MRI、单光子发射体层成像（SPECT）和正电子发射体层成像（PET）等技术为癌症诊断、分期和手术方案的制定提供了有效的指导信息。随着医学影像技术的发展，术中MRI 及CT 导航技术已应用于中枢神经系统肿瘤手术，但这些成像设备庞大、成本昂贵、操作复杂及辐射剂量大，故而限制了其在临床上的推广；另外，由于这些成像手段主要提供病灶形态学诊断，因此无法从分子、细胞层面对早期癌症病灶进行精准诊断[6-7]。基于靶向荧光对比剂的荧光成像术中导航通过分子探针特异性靶向癌灶组织，可显著提高病灶的信噪比，有望实现分子、细胞层面的癌灶边界界定，可精准指导术中病灶切除[8]。

荧光成像具有高灵敏度、无电离辐射、高空间分辨力的特点，适于实时指导手术切除。荧光成像系统可捕捉荧光对比剂在光源激发后发出的信号，而所有成像系统都可以集成到一个专用设备中，如集成到腹腔镜或手术机器人设备中，提供无接触、实时成像。术中荧光成像不仅可以更加精确地定位肿瘤的位置，显示其大小，而且为外科医生提供了清晰可见的淋巴结定位，已在头颈部黑色素瘤病人淋巴结定位中取得了令人满意的效果[9]。此外，该技术也已用于胃癌病人的根治手术，术中在瘤周注射荧光对比剂，应用术中荧光成像可帮助识别淋巴结，有助于进行全面的淋巴结清扫[10]。

2 荧光对比剂的特点及临床应用

荧光对比剂基于被动靶向或主动靶向原理富集到肿瘤部位后，可使靶肿瘤组织高灵敏和高对比显示，便于术中观察，从而提高手术安全性，缩短手术时间，降低二次手术的风险[11]。应用于临床的荧光对比剂需满足摩尔消光系数大、生物相容性好、分子质量小、与正常组织的非特异性吸附小、成本低、易制备的特点。常用的荧光对比剂有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、5-氨基乙酰丙酸、亚甲蓝及近红外荧光染料[如吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）、IRDye800CW、IRDye700DX][12]。FITC 是一种荧光素衍生物，已经被美国食品与药物监督管理局（FDA）批准用于人体，是临床最早使用的荧光染料之一[13]。然而，FITC 和血红蛋白的吸收峰相似，受生物组织自发荧光背景干扰大，导致FITC 荧光成像的对比度、敏感度降低。同时，FITC 易光漂白，这也导致其不能用于长时间成像，不适合于实时成像介导手术导航。5-氨基乙酰丙酸是生成血红素的前体物质，在蓝光照射下代谢产物可发出荧光，在临床试验中取得了良好的结果，有效降低了试验中手术切缘阳性率，显著延长了病人的无进展生存期，在2017 年获得FDA 的批准[14]。亚甲蓝主要用于输尿管、甲状腺结节和神经内分泌肿瘤显像。

发射波长＜600 nm 的荧光成像可受到生物组织散射和血红蛋白吸收的限制，而波长＞1 300 nm 的荧光成像会受到水吸收干扰[15-16]。因此，发射波长在近红外区域的荧光对比剂备受关注，其具备更深的组织穿透力，且光散射更少，受自发荧光干扰小[17]。近红外激光的独特性质使其适用于高信噪比肿瘤成像和实时术中导航。近红外荧光染料中，ICG 具有相对较低的组织吸收和较高的量子产率，是目前临床手术导航应用最广泛的近红外荧光对比剂，主要用于血流评估、前哨淋巴结定位和肝脏肿瘤成像[18]。ICG 是一种水溶性的、带负电的、两亲性三碳菁类染料，分子质量约776 u，其最大激发波长为780 nm，最大发射波长为820 nm，有利于生物医学成像[19]。更重要的是，ICG 可在血液循环中迅速与白蛋白结合形成5~10 nm 大小的复合物，通过肿瘤组织特有的增强渗透与保留效应在肿瘤组织中富集。

目前，ICG 已被用于多种肿瘤的术中导航切除，包括乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌等[5]。ICG 荧光融合影像技术可实时对肿瘤边缘显像，且有助于发现术前影像检查未能发现的微小病灶。但由于其受穿透深度的限制，当病灶深度超过1.3 cm 时难以检测到荧光从而产生假阴性结果。因此，综合利用术前影像及术中荧光成像技术，可更全面地评估病灶情况。Kawakita 等[20]采用ICG 作为荧光探针，对肝癌肺转移病人进行了荧光成像术中导航病灶切除，在手术过程中通过观察ICG 荧光来确定转移灶的位置和边缘；同时对切除的组织标本进行荧光成像来评估手术切缘是否阳性。该研究结果表明ICG 荧光成像有助于识别肿瘤转移灶，能够辅助制定更高效的手术方案。Pan 等[21]应用ICG 作为近红外荧光对比剂，评估了近红外荧光成像在口腔鳞癌术中检测手术切缘的效果，研究首先进行了细胞和动物实验来探索荧光成像识别手术阳性切缘的可能性，然后纳入了20 例口腔鳞癌病人，在手术过程中采集近红外荧光图像和定量荧光强度来检测手术切缘，结果显示，原发肿瘤切除后有4 例（4/20）切缘出现异常荧光信号，其中2 例经病理证实为残留肿瘤组织，结果表明近红外荧光成像在口腔鳞癌根治术中有重要的辅助价值。

相比传统的近红外荧光探针（发射波长：700~900 nm），近红外二区（near infrared-Ⅱ，NIR-Ⅱ；发射波长：1 000~1 700 nm）荧光探针的分辨率更高，更适用于活体成像。但是，包括半导体无机纳米材料和小分子有机染料等现有的NIR-Ⅱ荧光对比剂，在临床转化方面都面临着重大挑战。然而，近红外Ⅰ区（NIR-Ⅰ）染料（如ICG、IR-800CW 和IR-12N3）的光谱显示了长达1 500 nm 以上的发射波长，可直接用于NIR-Ⅱ成像。因此，除了正在临床试验中的NIR-Ⅱ荧光探针之外，重新利用NIR-Ⅰ染料，为NIR-Ⅱ成像的临床转化开辟了一条捷径[22]。Hu 等[23]首次应用ICG 作为荧光对比剂，对肝癌病人进行了NIR-Ⅱ荧光成像术中导航研究，取得了优异的成果。该研究开发了一种新型光学成像设备，能够将可见光成像系统与NIR-Ⅱ和NIR-Ⅰ荧光集成在一起，使用ICG 作为荧光探针，对23 例肝癌病人进行了荧光成像引导的原发性和转移性肝癌手术切除。与NIR-Ⅰ成像相比，术中NIR-Ⅱ成像可提供更高的肿瘤检测敏感度，使肿瘤与正常肝组织的对比明显增强，肿瘤检出率更高。因此，结合近红外荧光和适合的荧光探针可能会带来更好的荧光成像术中导航效果。

3 靶向荧光成像探针的制备及应用

靶向分子成像探针可特异性靶向于肿瘤组织中的受体或分子，除了可视化常规解剖结构以外，还可提供病灶分子信息，并有望通过提高早期癌症诊断、肿瘤分期、风险评估和指导治疗的诊断性能来推进精准医学发展。荧光分子成像技术可实时、多通道地提供病灶组织中丰富的分子信息。

大多靶向荧光对比剂是由荧光染料和治疗性单克隆抗体制备而成。此外，蛋白质工程和药物设计的进步也促进了靶向荧光对比剂的开发。目前用于制备光学分子成像探针的靶向配体包括多肽、抗体、适配体、可特异性响应于肿瘤组织的分子等，靶向配体从大分子到纳米颗粒不等[24-25]。其中，适合于临床转化的靶向探针必须具备良好的生物相容性、特异性，可在肿瘤组织中长时间滞留且从正常组织中快速清除，从而产生高信噪比成像效果。一般来说，较小的分子具有良好的药代动力学特征，可更快地从体内代谢；此外，探针的长期稳定性、活体内完整性、易于制备和安全性也是探针评价的重要指标。该成像系统应该具备便携、绝缘性、易于定位以及能够在几厘米的视野范围内提供微米分辨率的特点。

许多靶向荧光探针已经开发并正在进行临床评估。例如，叶酸受体α 靶向荧光探针叶酸-FITC13，c-MET 靶向光学探针GE-13714 和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）靶向探针西妥昔单抗CW15[5,23]。此外，IRDye800CW是一种成像性能优越的近红外荧光染料，西妥昔单抗-IRDye800CW 靶向探针可靶向EGFR，能显著提高癌症病灶与正常组织的对比度。最近，西妥昔单抗-IRDye 800CW 和贝伐单抗-IRDye800CW（靶向VEGF）也已进入靶向荧光成像术中导航的临床试验[1]。值得注意的是，由于西妥昔单抗和IRDye800CW的结合，使其循环半衰期显著缩短，快速清除单克隆抗体-染料结合物有助于降低背景信号，从而进一步提高肿瘤组织成像的信噪比[26]。西妥昔单抗-IRDye800CW 荧光探针已被应用于头颈鳞状细胞癌、胶质瘤、胰腺癌的靶向荧光成像术中导航[27-29]；贝伐单抗-IRDye800CW 荧光探针被用于结肠癌、结直肠癌腹膜转移瘤、乳腺癌、软组织肉瘤等靶向荧光成像术中导航[30-31]；帕尼单抗-IRDye800CW 靶向荧光探针已被用于胶质瘤、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胰腺导管腺癌的荧光成像术中导航[32-33]以及口腔鳞状细胞癌的转移性和前哨淋巴结定位[34]。Zhou 等[32]应用帕尼单抗-IRDye800CW 进行了高级别胶质瘤术中荧光成像导航，并开展了临床一期实验，首先评估了抗EGFR 抗体帕尼单抗-IRDye800CW在亚治疗剂量下的安全性和可行性，然后对11 例高级别胶质瘤病人注射低剂量（50 mg）或高剂量（100 mg）的帕尼妥单抗-IRDye800CW，并在术中进行近红外荧光成像，通过比较肿瘤和正常组织的平均荧光强度来确定最佳成像剂量；体外成像发现，可在体外检测到5 mg 的肿瘤碎片，检测阈值呈剂量依赖性。在组织切片中，帕尼单抗-IRDye800CW 检测肿瘤组织的敏感度为95%，特异度达96%。帕尼单抗-IRDye800CW 在高级别胶质瘤病灶部位富集，与EGFR 过度表达和血脑屏障受损相关，而正常脑组织只显示出微弱的荧光。术中荧光改善了肿瘤组织的光学对比度，对比度、噪声比分别为9.5±2.1 和3.6±1.1。这项基于不同剂量帕尼单抗-IRDye800CW的人体研究表明，帕尼单抗-IRDye800CW 用于高级别胶质瘤病人荧光术中导航是安全可行的，且可增强肿瘤核心以及浸润性肿瘤边缘的可视化。近年，基于IRDye800CW 的靶向对比剂已被应用于多项临床试验（表1）[17]，证明了荧光成像术中导航的重要医学价值。

表1 基于IRDye800CW 的靶向对比剂用于荧光成像术中导航临床试验汇总

4 小结与展望

随着分子成像技术的不断改进，荧光成像术中导航将朝着“精准外科治疗”的概念发展，术中导航可能会针对每例病人特定的疾病过程进行个体化设计。尽管要实现这一目标还需要做出更大的努力，但靶向荧光成像探针的数量、种类以及探针的性能和安全性都正在迅速提升，这为将来精准医疗提供了更多的可能性。荧光成像术中导航仍面临亟需解决的瓶颈问题：首先，如何进一步提高分子探针的靶向性及荧光的组织穿透能力，如何提供多维解剖结构信息等。未来科研工作者需要发掘和探索更多肿瘤生物标志物及其对应的靶向分子，进一步提高分子成像的特异性。其次，NIR-Ⅱ成像有更强的组织穿透能力，因此还需进一步拓展完善用于术中导航的NIR-Ⅱ荧光染料。再次，成像手段需向多模态成像模式发展，以期在术中同时展示病灶三维解剖位置、周围组织关系及分子信息，为术中导航提供更丰富的病灶信息。

综上，荧光成像技术操作简单、快速实时、安全无辐射，容易集成到不同的外科手术和介入治疗中，具有良好的临床推广应用前景，已经显示了辅助外科手术的潜力和改善临床手术效果的可行性。虽然荧光成像术中导航技术取得了令人满意的初步结果，但仍需要明确的疗效研究、更多有潜力的新型靶向对比剂以及先进的图像处理软件的研发来推动该领域的快速进步和临床转化应用。