核黄素通过激活SCAD抑制小鼠心力衰竭

徐庆萍, 钟小艺, 秦 学, 冯静韵, 彭 欢, 苏永少, 马智超, 周四桂

(广东药科大学1. 中药学院，广州 510006；2. 附属第一医院临床药学重点专科，广东 广州 510699)

心力衰竭是人类健康的“第一杀手”，是心血管疾病的终末阶段。心力衰竭属于发病率、住院率和死亡率高的疾病，甚至比许多癌症还高[1]，随着现代社会老龄化趋势逐渐增强，心血管疾病发病人数逐年上升，因此，寻找更有效的心力衰竭治疗药物迫在眉睫。

心肌能量代谢障碍与心力衰竭的发生密切相关[2]。短链酰基辅酶A脱氢酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD)是脂肪酸β氧化的限速酶，催化短链酰基辅酶A的脱氢反应[3]。我们的前期研究发现,SCAD在慢性高血压、心肌梗死后心力衰竭大鼠及心肌细胞凋亡模型中表达显著下调[4-6]，而SCAD重组腺病毒能明显改善大鼠心肌梗死后心力衰竭[7]。核黄素(riboflavin)又称维生素B2，其在体内代谢产物之一为黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)，FAD是真核细胞中大量脱氢酶的辅酶[8]。FAD参与酰基辅酶A脱氢酶家族发挥生理作用的过程，而SCAD是酰基辅酶A脱氢酶家族成员中和FAD绑定最紧密的一员[9]。本课题组前期研究表明，FAD可通过激活SCAD来抑制大鼠病理性心肌肥厚以及心肌纤维化[10]。研究发现，核黄素能减轻大鼠I型糖尿病心力衰竭和小鼠心肌梗死模型的心肌损伤[11-12]。然而，核黄素能否通过提高FAD含量，激活SCAD从而抑制压力超负荷诱导的小鼠心力衰竭，尚不清楚。

本研究采用主动脉弓缩窄术(thoracic aortic constriction, TAC)构建压力超负荷诱导的小鼠心力衰竭模型，术前1周及术后8周进行核黄素灌胃治疗，观察核黄素对压力超负荷诱导小鼠心力衰竭的作用及其防治机制，为核黄素用于临床防治心力衰竭提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂SPF级C57BL/6J小鼠40只，♂，体质量(20±2)g，购自广州中医药大学实验动物中心。许可证号：SCXK(粤)2018-0034。核黄素(Sigma，批号：WXBD28883V)、SCAD酶活性试剂盒(GENMED，批号：1-2018412-10)、SYBR Green (TaKaRa，批号: AJ12457A)、多克隆兔抗SCAD(ProteinTech，批号：00012655)、多克隆兔抗Bcl-2(ProteinTech，批号：00083551)、多克隆兔抗Bax(ProteinTech,批号：00082363)、多克隆兔抗cleaved-caspase-3(ProteinTech,批号：00088666)、单克隆鼠抗GAPDH(ProteinTech，批号：10013030)、ATP试剂盒(碧云天，批号：082720201203)、FAD酶联免疫吸附测定试剂盒(上海双赢生物科技，批号：202106)、游离脂肪酸试剂盒(南京建成，批号：20210813)。

1.2 仪器紫外可见分光光度计(SHIMADZU)，全自动酶标仪 (SpectraMax i3x)，化学发光仪(上海勤翔)，酶标仪(Thermo)，荧光定量PCR仪(伯乐)，电仪分析天平(SHIMADZU),微量分光光度计(ALLSHENG Nano-100)。

1.3 小鼠TAC术诱导心力衰竭模型构建以及核黄素干预选取8周龄C57BL/6J ♂小鼠48只，适应性饲养1周后，随机分为4组：Sham组(10只)、Sham+核黄素组(10只)、TAC组(14只)以及TAC+核黄素组(14只)。采用TAC术构建压力超负荷小鼠心力衰竭模型，用0.45%戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)腹腔注射麻醉小鼠后，打开小鼠胸腔，TAC组用0.5 mm孔径的垫针结扎主动脉弓，Sham组只开胸穿线但不结扎。Sham+核黄素以及TAC+核黄素组术前1周以及术后8周进行灌胃给药核黄素(20 mg·kg-1·d-1)，Sham以及TAC组小鼠予以相同体积的生理盐水灌胃，TAC组及TAC+核黄素组小鼠在手术过程和术后各死亡4只，而Sham组以及Sham+核黄素组在8周内无小鼠死亡情况，40只小鼠进行后续实验。术后8周各组10只小鼠进行超声心动图检测后取材，并进行心脏体重比检测。后续实验随机选取每组各6只小鼠用于染色、蛋白表达及生化指标检测。

1.4 超声心动图检查TAC术后8周，各组小鼠经异氟烷(剂量控制：0%～5%)吸入麻醉后，进行心脏超声检测。测量小鼠的各心功能指标：心脏射血分数(ejection fraction, EF)和心脏的缩短分数(fractional shortening, FS)、收缩末期左心室内径(left ventricular dimensions at end systole, LVIDs)和舒张末期左心室内径(left ventricular dimensions at end diastole, LVIDd)、心博出量(cardiac output, CO)、心每博输出量 (stroke volume, SV)、收缩末期左心室容积(left ventricular end systolic volume, LVESV)和舒张末期左心室容积(left ventricular end diastole volume, LVEDV)等。

1.5 动物取材各组小鼠取材前12 h禁食，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，经摘眼球取血后，静置血样分离血清，心脏用冷冻PBS充分灌注后，取出心脏。部分心脏组织以及全部血清及时速冻置于-80 ℃保存，部分心脏组织经4%多聚甲醛固定进行石蜡包埋切片。

1.6 心肌组织形态学检查用组织固定液固定部分心脏组织，石蜡包埋后切片，之后采用TUNEL荧光染色法检测心肌细胞凋亡情况并计算凋亡阳性细胞数占比，从而判断心力衰竭程度。采用免疫荧光染色法检测SCAD在心肌组织的表达。

1.7 线粒体膜肿胀程度检测用组织线粒体分离试剂盒提取小鼠心肌组织线粒体，全波长酶标仪测定线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)开放情况，用BCA试剂盒测定线粒体蛋白含量。配制线粒体反应缓冲液，其组分为[150 mmol·L-1KCl、10 mmol·L-1Tris、20 mmol·L-1MOPS、5 mmol·L-1KH2PO4(pH 7.4)]，加入相同质量浓度的线粒体后，在540 nm波长处，每间隔1 min，测试20 min，检测吸光度值的下降幅度，设吸光值变化的量ΔA，初始为A，以ΔA/A表示小鼠心肌组织中线粒体膜肿胀程度。

1.8 线粒体膜电位检测用上述线粒体提取试剂盒提取心肌线粒体后，具体步骤严格按照试剂盒进行，测定JC-1单体及其聚合物的荧光强度。统计各组相对对照组的JC-1聚合物与单体荧光强度比值，即为各组的心肌线粒体膜电位变化。

1.9 心肌中FAD含量检测用生理盐水捣碎心肌组织后，离心后取上清，得组织匀浆，之后严格按照试剂盒实验步骤进行检测。

1.10 ATP含量测定用试剂盒提供的ATP检测裂解液裂解心肌组织后，把所测得的样品荧光值代入根据试剂盒制得的标准曲线中，得ATP浓度，同时进行蛋白定量，检测各组心肌组织中ATP含量。

1.11 SCAD酶活性检测根据2,6-二氯靛酚钠作为人工电子受体，在SCAD的催化下，由短链脂酰辅酶A乙酰辅酶A提供的电子，经过硫酸钾脂吩嗪的传递，产生其还原产物的吸光度值降低的原理，采用比色法进行SCAD酶活性测定，具体操作严格按照说明书进行。

1.12 游离脂肪酸含量检测游离脂肪酸能与铜试剂反应生成对应铜盐，采用紫外分光光度计测定各组样品OD数值，代入试剂盒提供的计算公式，得心肌与血清中游离脂肪酸含量，具体操作严格按照说明书进行。

1.13 Western blot分析用RIPA裂解液裂解心脏组织，提取蛋白，用BCA试剂盒蛋白定量后，100 ℃煮沸蛋白5 min。配浓缩胶以及分离胶，控制每块胶的梳孔上等量蛋白样品，随后进行电泳，条件为浓缩胶70 V，30 min，分离胶120 V，90 min。按照快速转膜法进行转膜，转膜条件为：330 mA，37 min。转膜结束，TBST缓冲液洗膜，再用5%BSA溶液室温封闭1.5 h。封闭后，一抗4 ℃孵育过夜，一抗的稀释比为：SCAD抗体(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶2 000)、cleaved caspase-3(1 ∶1 000)、pro-caspase-3(1 ∶1 000)、GAPDH抗体(1 ∶100 000)。d 2用TBST缓冲液洗膜后，室温孵育二抗1 h，二抗稀释比为兔抗(1 ∶10 000)、鼠抗(1 ∶10 000)。最后TBST缓冲液洗膜后，用化学发光仪进行蛋白表达检测。

1.14 Real-time PCR用裂解液TRIzol裂解心肌组织，提取RNA，随后测定RNA的纯度和浓度。根据试剂盒说明书操作，把RNA反转录后合成cDNA，保存于-20 ℃冰箱中。d 2，配制RT- PCR 反应体系，上机检测。小鼠源SCAD基因引物序列见Tab 1。

Tab 1 Real-time PCR experimental gene primer sequences

2 结果

2.1 核黄素对小鼠心脏体重比的影响由Fig 1所示，与Sham组相比，TAC诱导心力衰竭模型组的小鼠心脏体重比明显增大(P<0.01)；与TAC组相比，TAC+核黄素组小鼠心脏体重比明显减小(P<0.01)，表明核黄素明显改善了压力过载诱导心力衰竭小鼠的心脏体积与重量增加。

Fig 1 Comparison of ratios of heart weight (HW)/body weight (BW) of mice in each n=10)

2.2 核黄素对小鼠超声心动图的影响如Fig 2A所示，Sham组和Sham+核黄素组左心室壁收缩舒张功能正常，TAC组左心室壁出现收缩舒张功能障碍的情况，心室腔增大。与TAC组相比，TAC+核黄素组收缩舒张功能明显增强，心室腔减小。如Fig 2B所示，与Sham组相比，TAC组的心输出量、每搏输出量、EF值和FS值均明显减小(P<0.01)，而收缩/舒张末期左心室内径与容积均明显增大(P<0.01)，表明TAC术后8周小鼠心脏收缩舒张功能障碍，心脏射血能力及心功能指数明显下降，心力衰竭模型构建成功。与TAC组相比，TAC+核黄素组的上述指标均得到明显改善。以上结果表明，核黄素能明显延缓TAC手术后小鼠发展为心力衰竭的病理进程。

Fig 2 Changes of echocardiography in each group n=10)

2.3 核黄素对小鼠心肌细胞凋亡的影响由Fig 3 TUNEL荧光结果图显示，凋亡细胞呈现绿色荧光。其中Sham组及Sham+Riboflavin组左心室没有出现明显的细胞凋亡现象；与Sham组比较，TAC组左心室阳性凋亡细胞数明显高于Sham组(P<0.01),出现大量细胞凋亡现象。与TAC组相比，TAC+Riboflavin组左心室心肌细胞凋亡情况得到明显改善，阳性凋亡细胞数明显下降(P<0.01)，表明核黄素具有抗心肌细胞凋亡的作用。

Fig 3 TUNEL staining of mice in each group (400×) n=6)

2.4 核黄素对小鼠心肌组织凋亡蛋白表达的影响如Fig 4所示，与Sham组相比，TAC组小鼠的心肌组织促凋亡蛋白Bax与cleaved-caspase-3表达均明显增加(P<0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少(P<0.01)。与TAC组相比，TAC+Riboflavin组心肌组织促凋亡蛋白Bax与cleaved-caspase-3表达均明显减少(P<0.01)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显增加(P<0.01)，以上变化与心肌组织TUNEL荧光染色结果一致，表明核黄素能够明显改善心肌细胞凋亡。

Fig 4 Expression of apoptotic protein in myocardial tissues of mice in each group n=6)

2.5 核黄素对小鼠心肌组织中SCAD表达、酶活性以及FAD含量的影响由Fig 5A-C所示，与Sham组相比，TAC组小鼠心肌组织中SCAD的蛋白、mRNA表达和其酶活性均明显减少(P<0.01)；与TAC组相比，TAC+Riboflavin组小鼠SCAD蛋白、mRNA在心肌组织中表达及其酶活性均明显增加(P<0.01)。由Fig 5D所示，与Sham组相比，TAC组小鼠心肌组织中FAD含量明显减少(P<0.01)；与TAC组相比，TAC+Riboflavin组小鼠心肌组织中FAD含量明显增加(P<0.01)，表明核黄素可能通过提高FAD水平，从而激活SCAD，起到抑制压力超负荷诱导的小鼠心力衰竭作用。

Fig 5 SCAD protein, mRNA, enzyme activity and FAD content in myocardial tissues of mice in each group n=6)

2.6 核黄素对小鼠心肌组织中SCAD免疫荧光的影响如Fig 6所示，与Sham组相比，TAC组小鼠心肌组织SCAD免疫荧光明显减弱，SCAD表达明显下调(P<0.01)；与TAC组相比，TAC+Riboflavin组小鼠心肌组织SCAD免疫荧光明显增强，SCAD表达明显上调(P<0.01)，与SCAD的mRNA及酶活性水平变化一致。

Fig 6 SCAD immunofluorescence staining in myocardial tissues of mice in each group n=6)

2.7 核黄素对小鼠心肌能量代谢的影响如Fig 7A、B所示，与Sham组相比，TAC组小鼠心肌线粒体膜电位明显下降(P<0.01)，膜肿胀程度明显增加(P<0.01)；与TAC组相比，TAC+Riboflavin组小鼠心肌线粒体膜电位显著上升(P<0.01)，膜肿胀程度明显减少(P<0.01)。表明TAC组小鼠心肌线粒体功能障碍，核黄素干预后小鼠心肌线粒体功能得到明显改善。如Fig 7C所示，与Sham组相比，TAC组心肌组织中ATP含量明显减少(P<0.01)；与TAC组相比，TAC+Riboflavin组心肌组织中ATP含量明显增加(P<0.01)。与Sham组相比，TAC组心肌以及血清中的游离脂肪酸含量均明显增加(P<0.01)；与TAC组比，TAC+Riboflavin组心肌以及血清中的游离脂肪酸含量均明显减少(P<0.01)。表明核黄素可能通过激活SCAD，改善心肌能量代谢，从而抑制小鼠心力衰竭。

Fig 7 Changes of cardiac mitochondrial membrane potential and membrane swelling, myocardial tissue ATP, and free fatty acids in tissues and serum in each group of mice n=6)

3 讨论

心力衰竭最基本的表现为心肌收缩舒张功能障碍，供血能力降低，不能满足机体正常活动需要。心肌能量代谢障碍与心力衰竭发生密切相关。生理状态下，心肌中线粒体脂肪酸β氧化提供70%能量供应。在心力衰竭情况下，心肌代谢方式由脂肪酸β氧化转变成葡萄糖氧化，此时，脂肪酸大量积累，其氧化能力减弱，而葡萄糖氧化产生的能量却不足以供应心肌正常能量需要[13]。

SCAD是脂肪酸β氧化限速酶，也是黄素蛋白之一，在心肌能量代谢中发挥重要作用。我们前期研究显示，SCAD对心力衰竭具有负性调控作用。FAD为核黄素在体内代谢的产物，是体内多种黄素蛋白参与氧化还原反应的辅助因子，而FAD可调节SCAD的基因表达[14]。核黄素作为FAD的前体，在体内可转化成FAD。临床上，核黄素主要用于防治口、眼和外生殖器部位的炎症如口角炎、眼结膜炎和阴囊炎等核黄素缺乏病。近年来，研究发现核黄素与许多新的临床疾病相关，如秋季腹泻、烧伤以及心血管疾病等[15]。其中心力衰竭与核黄素的关系近年来似乎得到研究者的青睐。相关研究表明，大多数心衰病人存在微量营养素缺乏症，而且心衰病人比普通人群更易患有B族维生素缺乏症[16]。核黄素作为B族维生素之一，参与机体大量的能量代谢过程，同时也是心衰病人的营养补充剂。缺乏B族维生素可能是心衰病人心肌能量供应不足的原因之一，给予心衰病人适当补充B族维生素有利于改善患者心肌能量代谢[17]。因此，本研究进一步探索核黄素对压力超负荷诱导小鼠心力衰竭的作用及其作用机制。

本研究发现，在TAC诱导压力超负荷导致心力衰竭病理状态下，TAC组小鼠出现了明显的心肌收缩舒张功能以及线粒体功能障碍，线粒体膜电位减少，膜肿胀程度增加，心肌细胞出现大量凋亡。核黄素治疗后小鼠的心肌收缩舒张功能以及线粒体功能均得到明显改善，心肌细胞凋亡数明显减少，表明核黄素能有效延缓心力衰竭的病理进程。TAC组小鼠心肌中FAD含量明显降低，ATP含量明显减少，心肌和血清中游离脂肪酸含量明显增加， SCAD表达明显减少、酶活性降低，表明压力超负荷小鼠出现了明显的心肌能量代谢障碍。经核黄素治疗后，小鼠心肌中FAD含量明显增加、SCAD酶活性及ATP含量显著增加，游离脂肪酸含量明显减少，表明核黄素能显著改善TAC诱导压力超负荷小鼠的心肌能量代谢障碍。

已有研究表明，核黄素可通过提高血红素氧合酶-1蛋白表达和超氧化物歧化酶活性，从而降低心肌氧化应激，减轻大鼠经单次注射链脲佐菌素诱发Ⅰ型糖尿病的心力衰竭，显著改善左心室收缩舒张功能[11]。此外，有学者采用冠状动脉左前降支结扎术建立小鼠急性心肌梗死后心力衰竭模型，证实核黄素能减轻小鼠心肌梗死模型的心肌损伤[12]，这一作用是通过激活赖氨酸特异性脱甲基酶1的活性、调节相关磷脂代谢基因的表达来实现。本研究采用TAC术模拟长期压力超负荷诱导的心力衰竭，观察到核黄素对慢性心力衰竭具有相似的保护作用，且从心肌能量代谢新视角阐明了核黄素通过提高FAD含量、激活SCAD，促进线粒体脂肪酸β氧化反应，改善心肌能量代谢，抑制心肌细胞凋亡发挥作用，这可能是核黄素具有心脏保护作用的关键机制之一。以上研究结果为核黄素在临床上用于防治心力衰竭提供了实验基础和理论依据，具有十分重要的临床意义。然而，本研究由于样本量相对较少，得出的初步结果还有待于进一步验证。此外，有关核黄素通过激活SCAD抑制小鼠心力衰竭的分子机制，尚需进一步深入研究。