人乳头瘤病毒 E6/E7 mRNA检测在宫颈癌筛查中的应用价值

刘冬梅，张宁，范俊丽

南阳市第二人民医院1检验科，2产前诊断中心，河南 南阳 473000

人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）长期感染子宫可能导致子宫发生病变，但HPV对子宫组织的侵袭多为一过性，且机体由于拥有强大的自身免疫系统，因此，即使感染了HPV，一般也会在8个月～2年被清除[1]，因此，仅少部分女性HPV感染患者存在宫颈恶性病变。早期发现子宫癌前病变，就能早期给予积极治疗，以改善患者的预后。目前，临床对宫颈癌变的诊断一般可按照“三阶梯式”的流程[2]，采集受检者宫颈口等部位的细胞进行液基薄层细胞学检查（thin-prep cytology test，TCT）、HPV DNA检测，然后进一步通过阴道镜病理组织活检以明确诊断。由于所采集的是表面已脱落的细胞，采集不到较深部位的细胞，TCT检查容易漏诊，此外，若检测人员操作失误，也会导致细胞学检查的误诊。HPV DNA只能检测病毒的分型，属于病因检测，可对人体内病毒的感染程度及病毒活性等提供一些具体信息，但不能给予明确提示，容易出现灵敏度高但特异度低的情况[3]。通过TCT检查、HPV DNA检测高效筛查出宫颈病变的高危人群后，对其进行科学管理，可在一定程度上提高宫颈癌的临床治疗效果，但寻找一种更优的宫颈癌筛查方法是临床亟待解决的问题。

研究发现，宫颈癌进展过程中，HPV会在侵袭人体宫颈组织细胞时将自身的基因组整合到宿主细胞的基因组中，以促进宫颈细胞的恶性病变[4]。E6/E7是HPV基因组中最具有典型意义的肿瘤基因部分片段，HPVE6/E7mRNA作为病毒对自身E6/E7肿瘤基因片段的转录产物，其在人体内的表达情况对宿主细胞的恶变有一定意义。有研究认为，HPVE6/E7mRNA在人体内的表达水平与宫颈病变的严重程度有一定关联，且对高级别宫颈病变的筛查有重要意义[5]。目前，临床HPVE6/E7mRNA在人体内的表达水平与宫颈病变严重程度的研究较少，其是否对检测宫颈病变阳性患者的进一步分流具有价值尚需要更多的临床研究证实。此外，研究显示，宫颈癌的高发年龄为45～55岁，HPVE6/E7mRNA检测对不同年龄患者的检测灵敏度和特异度有一定差异[6-7]。也有研究发现，高龄患者HPVE6/E7mRNA检测阳性率普遍高于低龄患者，表明HPVE6/E7mRNA检测对不同年龄段女性有不同的临床诊断价值，可以进一步进行更为深入的研究[8]。因此，本研究选取350例TCT检查阳性患者作为研究对象，对其进行HPV DNA检测和HPVE6/E7mRNA检测，以阴道镜病理活检作为金标准，比较HPVE6/E7mRNA检测和HPV DNA检测的阳性率，探讨HPVE6/E7mRNA检测在不同年龄段宫颈病变筛查中的诊断价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月至2021年1月在南阳市第二人民医院TCT检查阳性的350例HPV感染患者。纳入标准[9]：①TCT检查均显示阳性但未明确意义；②接受HPV DNA检测和HPVE6/E7mRNA检测；③接受阴道镜病理活检。排除标准[10]：①已经确诊为宫颈癌；②既往接受过宫颈癌或癌前病变相关治疗；③合并其他系统恶性肿瘤；④合并自身免疫性疾病或正在接受免疫抑制治疗；⑤妊娠或哺乳期女性；⑥依从性差，不愿意配合本研究。350例疑似宫颈癌患者年龄21～69岁，平均（41±9）岁，其中≤30岁44例，31～40岁119例，41～50岁121例，≥51岁66例；TBS分级[11]：未见恶性细胞和上皮内病变细胞106例，不除外高度鳞状上皮内病变的不典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cells cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASCH）74例，低度鳞状上皮内病变（lowgrade squamous intraepithelial lesion，LSIL）81例，高度鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）42例，宫颈鳞状细胞癌47例；病变程度：宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅰ级144例，CINⅡ级108例，CINⅢ级51例，宫颈癌47例。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检查方法

1.2.1 TCT检查方法TCT检查不会对人体产生伤害，将TCT检查专用取材刷在受检者宫颈口处旋转几圈，采集宫颈部位的脱落上皮细胞，并将采集的细胞放置于保存液内，经过制片、固定、染色后进行检测。将非典型鳞状细胞不能明确意义（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）判定为TCT检查阳性。

1.2.2 HPV DNA检测将经TCT检查采集的细胞样本，使用亚能医用核酸分子杂交仪及配套试剂对常见的基因型进行分型检测，主要将HPV分为高危型和低危型，其中高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等，低危型HPV包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81及CP6108等。相对光单位（relative light unit，RLU）/临床阈值（cut off，CO）≥1.0判定为HPV DNA检测阳性。

1.2.3 HPVE6/E7mRNA检测按照HPVE6/E7mRNA检测试剂盒说明书对TCT检查所采集的样本进行处理后进一步行HPVE6/E7mRNA检测：3000 r/min离心5 min去除上清，对剩余部分进行清洗再次进行3000 r/min离心后去除上清，65℃进行细胞裂解，60 min后取出，恢复至室温后取上清液用于检测，将样本及样本缓冲工作液加入包被板中，依次经过预放大、放大、探针标记后，向样本中加入10∶1的2.5 mol/L的氢氧化钠，采用冷光仪进行HPVE6/E7mRNA检测。＞RLU判定为HPVE6/E7mRNA检测阳性。

1.2.4 阴道镜病理活检所有受检者均进行常规阴道镜病理活检，对宫颈3、6、9、12点部位及宫颈内疑似非正常组织进行病理活检，必要时可进行宫颈锥切以进一步明确诊断。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对所有数据进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或McNemar检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同TBS分级受检者HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA检出情况的比较

350例受检者中，HPVE6/E7mRNA阳性检出率为 77.71%（272/350），与 HPV DNA 的 76.57%（268/350）比较，差异无统计学意义（χ2=1.609，P＞0.05）。不同TBS分级受检者HPVE6/E7mRNA、HPV DNA的阳性检出率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同TBS分级受检者HPV E6/E7 mRNA及HPVDNA检出情况的比较[ n（%）]

2.2 不同年龄段受检者HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA检出情况的比较

不同年龄段受检者HPVE6/E7mRNA、HPV DNA的阳性检出率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。对于≤30岁受检者，HPVE6/E77 mRNA的阳性检出率低于HPV DNA检测，差异有统计学意义（χ2=16.056，P＜0.05）；对于31～40岁、41～50岁、≥51岁受检者，HPVE6/E7mRNA的阳性检出率均高于HPV DNA检测，差异均有统计学意义（χ2=8.245、5.332、7.146，P＜0.05）。（表2）

表2 不同年龄段受检者HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA检出情况的比较[ n（%）]

2.3 不同宫颈病变程度受检者HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA检出情况的比较

随着宫颈病变程度的升高，HPVE6/E7mRNA、HPV DNA的阳性检出率均逐渐升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；对于不同CIN分级受检者，HPVE6/E7mRNA阳性检出率与HPV DNA阳性检出率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同宫颈病变程度HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA检出情况的比较[ n（%）]

2.4 HPV E6/E7 mRNA与HPV DNA检测对宫颈癌的诊断效能

以阴道镜病理活检为金标准，病理活检诊断宫颈癌（阳性）47例，宫颈病变（阴性）303例。HPVE6/E7mRNA检测诊断宫颈癌的灵敏度为95.74%（45/47），特异度为25.08%（76/303），阳性预测值为16.54%（45/272）；HPV DNA检测诊断宫颈癌的灵敏度为87.23%（41/47），特异度为25.08%（76/303），阳性预测值为15.30%（41/268）。HPVE6/E7mRNA检测诊断宫颈癌的灵敏度高于HPV DNA检测。（表4）

表4 HPV E6/E7 mRNA与HPV DNA检测诊断宫颈癌的结果与阴道镜病理活检结果的对照

3 讨论

HPV长期反复感染女性宫颈组织，会使宫颈组织发生恶变，出现CIN，然后进展为早期浸润癌和浸润癌[12]。虽然HPV长期反复侵袭机体是导致宫颈病变及宫颈癌的重要原因，但感染过程中，宫颈病变进展不仅与HPV分型及HPV在人体组织内的病毒载量有关，还与HPV的活跃度密切相关。在宫颈病变筛查中，宫颈细胞学检查和HPV DNA检测已经成为应用较为普遍的CIN和宫颈癌筛查手段。宫颈细胞学检查方法包括传统巴氏涂片法和TCT检查。在巴氏涂片操作中，一些主观因素会导致其检测结果存在一定偏差，如操作不熟练导致涂片质量较差，采集的细胞数量不够等，这都增加了检测结果的假阴性率[13]。相比于巴氏涂片法，制片和细胞采集数量等对TCT检查结果的影响均较小，但TCT检查诊断CINⅡ级及以上（包括CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌）的灵敏度并没有明显提高[14]。目前，仅靠TCT检查不能有效筛选出宫颈病变的高危人群，漏诊率、误诊率均较高，因此，多数研究者认为可以将TCT检查联合HPV DNA检测作为更高效的检测方案[15-16]。虽然TCT检查联合HPV DNA检测已普遍应用于临床宫颈癌的筛查，在一定程度上提高了宫颈癌的检出率，但HPV DNA检测仅反映病毒感染的类型，属于病因学诊断，并不能明确反映HPV致癌基因的活性，TCT检查也仅在宫颈形态学改变后可以做出一定的诊断，不能在宫颈病变早期发挥诊断作用，因此，临床尚需要一些更有效的HPV检测方法。

研究发现，HPV基因组中存在一系列的致癌基因，其中以E6/E7基因较为典型。HPV长期感染人体宫颈组织后，HPV的基因组会与人体正常组织细胞的基因组进行一定程度的整合，病毒相关的致癌基因（E6/E7基因）会因此高表达，产生E6/E7肿瘤相关蛋白，与人体正常组织细胞的某些调节细胞周期的相关蛋白高度结合，促使组织细胞出现周期调节紊乱，从而不断增殖，形成肿瘤[17]。有研究表明，HPV在宿主细胞内进行基因重组后，所产生的E6/E7肿瘤相关蛋白中，E6蛋白会破坏p53抑癌基因的作用，使其失去促凋亡作用，促使细胞恶性增殖；E6蛋白还可以通过降解正常细胞内的PDZ蛋白，抑制细胞信号转导及黏附等过程，促进宫颈癌的发生发展；此外，E6蛋白可激活体内组织细胞中的端粒酶，可直接促进细胞增殖，从而促进宫颈癌的发生发展[18]。E7蛋白能够通过与Rb抑癌基因编码的pRb结合，促进对pRb与E2F所结合的复合物分解，抑制抑癌基因的活性，促使细胞恶性增殖。目前临床对HPVE6/E7的检测有一定难度，因此，可以通过检测HPVE6/E7转录产物HPVE6/E7mRNA水平，间接反映HPV在人体组织内的活性。对疑似宫颈病变患者进行HPVE6/E7mRNA检测有重要意义。

本研究结果显示，随着TBS分级的增高，HPVE6/E7mRNA的阳性检出率逐渐升高（P＜0.05）。提示HPVE6/E7mRNA检测对宫颈脱落细胞的检查可以为评估宫颈病变程度提供一定的参考依据，同时可以作为TCT检查的补充，更有效地提高筛查准确度。这可能是因为在细胞病变加重的过程中，E6/E7基因的表达也随之上调，HPVE6/E7mRNA阳性率逐渐增高。本研究结果显示，随着宫颈病变程度的升高，HPVE6/E7mRNA的阳性检出率逐渐升高（P＜0.05）。以阴道镜病理活检结果为金标准，HPVE6/E7mRNA检测诊断宫颈癌的灵敏度高于HPV DNA检测，与Derbie等[19]的研究结果一致。另一方面，HPVE6/E7mRNA检测对宫颈病变程度有较好的参考意义，对检测宫颈病变阳性患者的进一步分流有较高价值。这可能是因为宫颈组织没有异常病变时，HPV的E6/E7基因活性不高，由此转录mRNA的过程大量减少，检测结果更精准；也可能是因为HPV DNA检测对机体一过性HPV感染更为敏感，使其出现一定程度的误诊。

目前，临床对不同年龄段受检者HPVE6/E7mRNA的检测结果是否存在差异仍存在争议。有研究发现，不同年龄段受检者HPVE6/E7mRNA阳性检出率存在明显差异，年龄较大受检者HPVE6/E7mRNA阳性检出率明显高于年龄较小者，且年龄最小受检者的阳性检出率最低[20]。这可能是因为年轻女性的新陈代谢较快，抑癌基因活性较强，机体清除HPV感染的能力也强于年龄较大患者。本研究结果显示，HPVE6/E7mRNA检测对31～40岁、41～50岁、≥51岁患者的阳性检出率均高于HPV DNA检测（P＜0.05）。提示31岁及以上女性可以将HPVE6/E7mRNA检测作为宫颈病变的另一种筛查手段，也可以作为不同年龄的女性在初步接受细胞学检查后再接受进一步检查的二线筛查方式。这与Ren等[20]的结果不一致，这可能是因为不同年龄段的女性在感染HPV后，体内的HPV表达活性没有太大差异。但由于相关研究尚少，很多研究的样本量不够大，研究还不够深入，因此需要进一步深入研究进行证实。

综上所述，HPVE6/E7mRNA检测可作为宫颈癌及癌前病变的重要筛查方法，也可以用于初筛HPV阳性患者进一步评估宫颈持续病变的风险，明显提高宫颈癌的筛查效率，准确预测受检者宫颈病变的结局，在一定程度上对宫颈病变患者进行分流；同时，HPVE6/E7mRNA检测对不同年龄段女性的宫颈病变的筛查也有重要意义。