雄性大鼠原发性早泄模型的建立与评估

敦鑫龙，张 磊，高 明，陈 涛，郑万祥，魏 迪，鞠东恩，侯广东，陆 军，孟 平，袁建林

(1.空军军医大学西京医院泌尿外科，陕西西安 710032；2.延安大学附属西安大兴医院泌尿外科，陕西西安 710016；3.空军军医大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，陕西西安 710032)

早泄(premature ejaculation, PE)是临床最常见的男性性功能障碍疾病之一，最新的国内研究表明，PE患病率约为32%[1]。PE对于患者自身、家庭以及社会都有极大的负面影响。近年来随着社会发展、人民生活水平日益改善，人们对性生活的要求逐渐提高，对PE的治疗需求也逐渐增加。

目前在PE的基础研究中，建模方式主要有药物法[2]、电击法[3]以及交配筛选法[4]。其中交配筛选模型筛选出的PE大鼠，更接近于临床PE患者特点，越来越多地被运用于早泄机制研究中[5]。然而，目前基于射精频率(ejaculation frequency，EF)的交配筛选模型存在一些不足：例如相较于射精潜伏期(ejaculation latency，EL)，EF与早泄患者阴道内射精潜伏期(intravaginal ejaculatory latency time，IELT)的关联性较弱；再者，根据EF建立原发性早泄模型无法排除射精后间隔(post-ejaculatory interval, PEI)的影响，造成误差等。

本研究基于WALDINGER等[6-8]提出的射精分布理论，进行雌雄大鼠交配实验，依据EL建立原发性PE大鼠模型，并探究其可行性及优势，以期为早泄的相关研究提供更稳定可靠的工具。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性Wistar大鼠84只、雌性50只，均为11周龄，SPF级。Wistar大鼠均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，并且饲养在空军军医大学第三附属医院实验动物中心SPF级屏障内，温度和湿度环境适宜[8∶00-20∶00光照，20∶00-次日8∶00黑暗，40%～50%湿度，(22±2)℃室温]，饮水和摄食自由。实验前适应性饲养至少1周。

1.2 药品和仪器黄体酮注射液(10 mg/1 mL，杭州动物药品厂)、苯甲酸雌二醇注射液(4 mg/2 mL，杭州动物药品厂)，玉米油(R10106睿思科生物技术有限公司)，红外影像系统(浙江大华技术股份有限公司)，(50×40×30)cm3观察笼，常规外科手术器械一套。

1.3 动物的处理

1.3.1雌鼠去势手术 手术器械常规消毒，用7%的水合氯醛(0.4 mL/100 g)对雌鼠进行腹腔麻醉。雌鼠俯卧位，在脊柱两侧，两肋下缘与大腿根部之间，用剪刀剪去毛发后用碘伏消毒。纵向切开约1 cm的切口，分离皮肤与皮下组织，切开肌肉层约0.5 cm，打开腹腔，用镊子夹出脂肪组织。在脂肪组织中找到半径约为0.4 cm的粉红色卵巢(图1)。沿卵巢根部结扎脂肪组织后切除卵巢，将剩余组织放回腹腔后，逐层缝合肌肉层、皮下组织及皮肤，在创口涂抹红霉素软膏以防感染。对侧卵巢按照同样的步骤进行切除。术后注射50 000 U青霉素预防感染。放入恒温复苏箱中等待复苏。雌鼠术后恢复约2周。

图1 雌鼠去势手术中的卵巢

1.3.2雌性大鼠激素诱导发情 为了进行统一集中的交配实验，需要雌鼠同步发情。我们采用雌孕激素皮下注射的方式进行诱导[9]。分别在交配实验前48 h和4 h，对雌鼠颈部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.05 mL(玉米油溶解，0.4 mg/mL)及黄体酮注射液0.05 mL(玉米油溶解，10 mg/mL)。

1.3.3雄鼠交配行为的习得 在正式交配实验前1周，雄性大鼠与激素诱导发情的雌性大鼠1∶1合笼1晚，以加快大鼠对于性行为的适应和学习。

1.3.4大鼠交配的行为学实验 行为学实验时间为21∶00-次日1∶00，在黑暗的环境下进行，每只大鼠每周1次，共6次，记录后3周数据。实验步骤：关闭灯光，打开红外影像系统，将1只雄鼠放入观察笼中，适应5 min后，随机挑选1只激素诱导的雌鼠加入，记录1 h内的交配过程。交配实验后，回放录像，分析以下指标。骑跨潜伏期(mount latency, ML):从雌鼠放入到雄鼠第1次前肢爬高到雌鼠背部的时间(若第1次骑跨即插入，则骑跨和插入潜伏期一致)；插入潜伏期(intromission latency, IL):从雌鼠放入到雄鼠第1次插入阴道的时间；EL：从雄鼠第1次插入到第1次射精的时间(射精时刻以雄鼠身体剧烈抖动为准)；骑跨频率(mount frequency, MF):从雌鼠放入到雄鼠第1次射精之间的骑跨次数；插入频率(intromission frequency, IF):从雌鼠放入到雄鼠第1次射精之间的插入次数(射精时的插入不计)；EF：1 h内雄鼠的射精次数；PEI:雄鼠第1次射精到再次插入的时间间隔；插入比例(intromission ratio, IR): IR=IF/(IF+MF)。

2 结 果

2.1 大鼠性行为过程描述大鼠的性行为是一个连续规律的过程，经历嗅探、骑跨、插入、插入后舔阴、射精、射精后间隔等过程。嗅探(图2A)：当雌鼠加入时，雄鼠会嗅探雌鼠的阴部。骑跨(图2B)：雄鼠前肢放在雌鼠的背部，雌鼠或有向下弓腰的动作，整个过程持续大约1 s。插入(图2C)：雄鼠前肢放在雌鼠背部，同时雌鼠向下弓腰，臀部翘起露出阴部，雄鼠胯部用力向前抖动，插入过程持续约1 s。雄鼠插入后迅速后撤并舔舐自己的阴茎(图2D)。射精(图2E)：经过多次的插入、后撤、舔阴过程后，雄鼠进行一次剧烈的深插，身体剧烈抽动后，前肢缓慢从雌鼠后背上抬起并张开，雌鼠前撤，雄鼠在短暂停顿后舔舐自己的阴部。射精过程大约持续3～5 s。随后进入约5～10 min的射精后间隔(图2F)。射精后间隔指雄鼠在射精后动作减少或趴下休息，在此期间不论雌鼠有何引诱行为，雄鼠均无较大反应。交配过程中，雌鼠会有一些引诱行为，如短促的跳跃、扭动或咬扯等。图2为大鼠交配过程的典型动作图。

A：嗅探；B：骑跨；C：插入；D：插入后舔阴；E：射精；F：射精后间隔。图2 大鼠性行为过程典型动作图

2.2 不同表型大鼠性行为特征84只雄性大鼠中，有30只大鼠在交配实验中因无法完成完整的性行为过程(ML、IL或插入间隔过长且未射精)或不稳定(即交配实验中3周的EF相差大于2)而被排除。

2.2.1EF建模方式 54只雄性大鼠，绘制EF的频率分布直方图，可以看出EF近似呈正态分布：EF～N(μ,σ2)(3.76,1.402)。P-P图显示EF分布的正态性较强(图3)。

图3 EF频率分布直方图(A)及正态P-P图(B)

根据EF分布及10%[6]原则，将大鼠分为快速射精组(EF<3)、正常射精组(3≤EF≤5)及迟缓射精组(EF>5)，各组分别为5、41、8只，3组大鼠的EL明显递增(P<0.01)、EF明显递减(P<0.01)，其他参数差异无统计学意义(P>0.05)，其中ML与IL两指标进一步多重比较结果显示各组之间差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 EF建模方式中快速射精组、正常射精组及迟缓射精组雄鼠的性行为学特征

2.2.2EL建模方式 剩余54只雄性大鼠，绘制EL的频率分布直方图，可以看出EL近似呈正态分布：EL～N(μ,σ2)(1016.89,483.9662)。P-P图显示EL分布的正态性较强(图4)。

图4 EL频率分布直方图(A)及正态P-P图(B)

根据正态分布的概率分布规律可知，EL在(μ-σ,μ+σ)区间概率较大，为68.27%。故我们将EL<μ-σ定义为快速射精组，μ-σ≤EL≤μ+σ定义为正常射精组。EL>μ+σ定义为迟缓射精组将54只大鼠根据EL分组，分别为9、36、9只，三组大鼠的EL明显递增(P<0.01)、EF明显递减(P<0.01)、IF和PEI有不同程度的差异，而MF、ML、IL以及IR差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 EL建模方式中快速射精组、正常射精组及迟缓射精组雄鼠的性行为学特征

2.2.3行为学参数间的相关性 EL和EF之间相关系数为-0.704(P<0.001)，提示EL与EF间相关性强。

3 讨 论

WALDINGER教授等[7]提出的“射精分布理论”认为普通男性人群中IELT是连续的，PE男性的IELT是人群IELT生物变异中较小的部分，且后续的人群调查[8]及动物实验[6]均证明了这一理论。目前原发性PE建模的方式主要基于射精分布理论，通过雄性大鼠交配实验，根据EF将大鼠划分为不同性行为表型的组别，从而筛选出快速射精的大鼠[10-11]，这类大鼠的性行为表现与PE患者很相似。根据EF建立原发性PE大鼠模型的数据表明，在快速射精、正常射精以及迟缓射精3组大鼠中EF表现为显著减小、EL显著增大，这与早泄患者的IELT比正常人短这一主要特征一致。ML是代表性欲的参数[12]，在3组大鼠中差异无统计学意义，这与临床中原发性PE与性欲不相关这一特点相吻合[13]。在EL、EF、MF、ML、IL及IR这6个参数方面，EL建模方式与EF建模方式得出的结果相同，但在IF和PEI方面，EL建模方式显示3组大鼠间有不同程度的差异，而EF建模方式却未显示出其差异。 快速射精大鼠的IF比迟缓射精大鼠小，代表快速射精大鼠更少的插入即可射精，这与原发性早泄患者少量插入即射精类似。PEI为射精后到再插入的时间间隔，与大鼠的恢复能力有关，可以看出快速射精大鼠比迟缓射精大鼠状态恢复得更快。

以上分析可知，根据EL的建模方式比根据EF的建模方式能更好地体现出不同类型大鼠的性行为学差异。另外，以EF为参数建立原发性早泄模型无法排除PEI的影响，且EF还受到第2次及后续交配过程中其他参数的影响，这些都会增加误差，但以EL为参数的建模方式不会受到上述影响。再者，相较于EF，EL与原发性PE患者的IELT同为从插入到射精的时间计量，关联性较强。最后，EL和EF之间相关性较强(r=-0.704，P<0.001)，这也进一步证明了用EL建模的可行性。以上分析表明，以EL为参数建立原发性PE大鼠模型比以EF为参数的建模方式受到的影响因素更少，与IELT的关联性更高，能更好地表现出不同类型大鼠间性行为学的差异。

在实验过程中,我们发现根据EF建立原发性PE大鼠模型的方法存在需要改进之处：①在30 min内，大鼠的射精次数最多只能达到3次(这和其他研究有一定差异[14]。大鼠批次的差异或饲养环境的不同可能会导致这种差异)。为了扩大大鼠间行为学的差异，我们将交配时间增加到1 h。在此期间，大鼠的射精次数最多能达到7次。增加交配时长，可以扩大大鼠间EF的差距，有利于我们找到更稳定的快速射精大鼠。②在交配实验前1周，对雌雄大鼠进行合笼，这样可以加快雄鼠对交配行为的学习，加速雄鼠性行为的稳定。③在行为学录像过程中，采用有夜视功能的影像系统，营造出完全黑暗的环境，能更大程度地减小环境对大鼠的影响。④部分大鼠在交配过程中，未能完成射精，有些大鼠甚至没有插入。这部分大鼠很可能还未习得交配行为。另一方面，这一部分大鼠的EL实际值无法得出。故为了减少误差，我们在建模过程中，对于未能完成射精的大鼠予以排除。⑤以EF为参数建模的10%原则[6]，将EF分布两端10%的大鼠划分为快速射精和迟缓射精组。由于这一比例较小，在实验过程中为了筛选出一定数量的早泄大鼠，需要消耗更多的资源。所以我们根据EL呈正态分布的特征及正态分布概率区间，提出以μ-σ和μ+σ为分界，即将EL分布两端约15.87%的大鼠划分为快速射精和迟缓射精组。统计结果显示，这样的划分方式可以筛选出符合原发性PE患者特征的快速射精大鼠，且扩大了纳入范围，减少了实验消耗。

综上所述，根据EL建立原发性PE大鼠模型的方法可行，且在某些方面优于以EF为参数的建模方式。希望这一建模方式能为以后原发性PE的机制研究提供帮助。