板蓝根内源性肽的体外四种抗氧化活性研究*

何利思 林妙娜 蒋斌斌 彭美顺 张文瑜 韩嘉琪 刘西京

(深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518055)

板蓝根为十字花植物菘蓝(IsatisindigoticaFort.)的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽之效[1]。现代药理研究证实板蓝根具有抗流感病毒、呼吸道合胞病毒等广谱抗病毒作用[2]，又能抑制促炎性细胞因子的过度释放，减轻细胞因子风暴所造成的组织损伤[3]，对流感病毒导致的急性上呼吸道感染及肺炎有良好的疗效[4],常用于病毒感染性疾病的预防和治疗[1,5]。

目前，关于板蓝根“清热解毒”物质基础的研究虽然有大量的报道，但一直未取得共识。究其原因是板蓝根成分复杂，涵盖十大类别的180多个化学成分[5]，其中主要研究更多聚焦在小分子化合物上。本课题组研究发现，板蓝根的水提液中大分子成分(包括多糖和蛋白)占主要部分，关于多糖的研究较多，相反，蛋白和肽却鲜有研究。在前期工作中，本课题组发现，蛋白(多肽)在板蓝根中含量较高，总肽可达到6%～10%[6-7]；SDS-PAGE显示板蓝根蛋白条带主要为26 kD和34 kD[8]；动物体内实验表明，板蓝根蛋白多(肽)可明显延长流感病毒H1N1(A/PR8/34)感染小鼠的生存时间和降低死亡率(P<0.05或P<0.01)，能抑制病毒在小鼠肺部的增殖和抵抗病毒所致的肺炎(P<0.05或P<0.01)，并促进T细胞和B细胞的增殖[9]。因此，课题组认为蛋白(多肽)在板蓝根的生物活性调节中起到关键作用，是主要物质基础之一。

众所周知，蛋白不稳定，在胃肠中降解释放出肽和氨基酸调节人体的生理功能[10]。尽管构成蛋白的氨基酸只有20余种，但它们排列组合而形成的肽是无穷多的，是开发功能性食品和筛选药物的天然资源宝库。本课题组组前期的体外模拟降解实验也证实了该点[8]。但除了从母蛋白中降解的肽外，内源性肽生理活性同样不可忽视。本研究拟采用固相萃取技术分离纯化板蓝根中的内源性肽，研究其对DPPH自由基清除活性、超氧阴离子清除活性、羟自由基清除活性和还原力测试等四种体外抗氧化情况，从一个侧面反应板蓝根内源性肽在病毒、细菌感染过程中引起的炎性反应的生理调节作用，从而阐释内源性肽的“清热解毒”机理。相关研究未见报道。

1 仪器与试药

1.1仪器 DLF-18流水式中药粉碎机(温州顶历医疗器械有限公司)；N-1200B旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；KQ2200DE超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LSCplus冻干机(Christ)；SMP500-19313-NDSG酶标仪(Molecular Devices)；5810R离心机(eppendorf)；DKM410C恒温干燥箱(雅马拓)；XMTE-8112电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；THZ-98AB恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2试药 板蓝根(产地四川)；维生素C(上海国药集团化学试剂有限公司)；C18SPE固相萃取柱(Strata-Phenomenex C1855，70Å，500 mg，phenomenex)；牛血清白蛋白(BSA)和BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；水为超纯水；甲醇、二氯甲烷、铁氰化钾、三氯化铁及乙腈；三氟乙酸、三氯乙酸；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；邻苯三酚；50 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH=8.2)；0.2 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH=7)；0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH=7.4)、1,10-邻菲罗啉(邻二氮菲)、硫酸亚铁、双氧水及其它均为分析纯。

2 方法与结果

2.1板蓝根内源性肽的制备[11]已干燥板蓝根药材5 ℃低温粉碎，过60目筛，称取25 g用50 mL MeOH/H2O(6∶4，V/V)在室温下超声萃取三次，每次15 min，抽滤。提取液用100 mL的CH2Cl2萃取4次，水相减压回收甲醇，然后冷冻干燥，得到冻干品。冻干品溶于CH3CN/H2O(1∶9，V/V)，采用C18固相萃取(SPE)纯化。固相萃取采用MeOH活化，活化后用1%CF3CO2H水溶液平衡。冻干品溶液用溶剂A(H2O/0.1%CF3CO2H)：溶剂B(H2O/CH3CN/CF3CO2H，10/90/0.08%)8/2(V/V)洗脱8个柱体积，然后用溶剂A：B2/8(V/V)洗脱三个柱体积，该流份被认为富含肽，然后冷冻干燥备用。

2.2蛋白质含量测定 参考文献[6]结合BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定蛋白质的方法进行测定。线性回归方程为y=0.9715x+0.1047，r=0.9995。

2.3溶液的制备 称取板蓝根肽冻干样品适量(DPPH和还原力35 mg，其余试验15 mg)，置于10 mL容量瓶中，加入适量超纯水振摇溶解，用超纯水定容至刻度，摇匀即得。然后以此为基础分别稀释不同倍进行抗氧化活性测试。维生素C对照品溶液采用相应同法制备。

2.4抗氧化活性测试[12]

2.4.1DPPH自由基清除活性 取1.5 mL供试品溶液，用1.5 mL95%乙醇(含0.1 mmol·L-1DPPH)混合。避光放置30 min，在517 nm处测定其吸收度As。以超纯水与DPPH溶液混合测得吸光度为A0，样品与含0.1 mmol·L-1DPPH乙醇溶液混合测得吸光度为Ab，平行测定三份。按下式计算清除率：清除率(%)=[A0-(As-Ab))/A0]×100%。维生素C对照品溶液如法测定。

2.4.2超氧阴离子清除活性将2.8 mL 50 mmol·L-1Tris HCl缓冲液(pH=8.2)、0.1 mL HCl(10 mmol·L-1) 0.1 mL样品于25 ℃恒温20 min，再加入25 ℃预热的邻苯三酚(30 mmol·L-1)0.1 mL，迅速摇匀倾入1 cm比色皿中，在波长420 nm处每0.5 min测定一次吸光值共测4 min。计算溶液吸光度随时间的变化率ΔA1。A0为不加样品的邻苯三酚自氧化速率，平行测定三份。对照品维生素C如法操作。按下列公式计算：清除率(%)=[(A0-A)/A0]×100%。

2.4.3羟自由基清除活性[13]在10 mL量瓶中依次加入9 mmol·L-1FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol·L-1的水杨酸溶液1.0 mL、供试品溶液1.0 mL，8.8 mmol·L-1的H2O2溶液1.0 mL，摇匀，37 ℃水浴30 min,于510 nm处测其吸光度，记为Ai。另用蒸馏水代替H2O2溶液重复上述试验，测得参比吸光度Ab；另用蒸馏水代替供试品溶液重复上述试验，测得空白吸光度A0，Vc对照品如上法测定，平行测定三份。羟自由基清除率按下试计算：Y=[1-(Ai-Ab)/A0]×100%。

2.4.4还原力测试[14]25 mL容量瓶中分别加入供试品溶液2.5 mL、1%铁氰化钾2.5 mL和0.2 mL PBS(pH=7.0)2.5 mL，摇匀后50 ℃水浴20 min，冷却后加入10%醋酸溶液2.5 mL和0.1%氯化铁溶液2.5 mL，用蒸馏水定容，摇匀后静置10 min，离心(5000 g，4 ℃，10 min)，在700 nm处测其吸光度，以供试溶液本身作为空白对照，平行测定三份Vc对照品如法测试，在相同浓度条件下，吸光度越大，还原力强。

2.5结果

2.5.1DPPH自由基清除活性 从结果可知，对照品Vc作为经典的抗氧化物质，无疑有着强大的清除DPPH自由基的能力。板蓝根内源性肽样品虽然在清除程度上不能与之相比，但在一定的浓度范围内，随着浓度的增加清除活性逐渐增强，呈现一定的“量-效”关系，在较高浓度清除率也达到了85.49%，有较好的抗DPPH自由基活性，见表1。

表1 DPPH自由基清除率

2.5.2超氧阴离子清除活性 见表2。

表2 超氧阴离子清除率

从结果可以看出，对照品Vc对超氧阴离子有一定的清除率，尤其是高浓度基本是100%清除率。但样品的作用却不明显，结果表明，板蓝根内源性肽基本无超氧阴离子清除作用。

2.5.3羟自由基清除活性 见表3。

表3 羟自由基清除率

由结果可知，板蓝根内源性肽对在一定的浓度范围内，随着浓度的增加清除活性逐渐增强，对羟基自由基的清除呈现一定的“量-效”关系，最高可达83.54%，且在低浓度下也达到了72.17%。结果表明板蓝根内源性肽对羟自由基有着良好的清除作用。

2.5.4还原力测试 见表4。

表4 还原力测试吸光度

还原力测试实验是根据Fe3+被还原为Fe2+，生成普鲁士蓝，在700 nm处出现最大吸收，通过测量样品吸光度的变化来测量其抗氧化能力。吸光值愈高表示样品的还原力也就越强。本试验中，样品与对照品Vc随着浓度的增加，吸光度亦随之变大，表明样品与对照品Vc的还原能力也随之增强，且样品的吸光度较对照品高，结果表明，板蓝根内源性肽有着良好的还原力。

3 讨论

植物中的内源性肽来源于植物对周围环境伤害的防御反应，从而释放出免疫调节肽[15]，中药材也可能来自采收、贮藏和炮制的作用引起蛋白或大的肽的降解。由于肽具有广泛的生理活性，具有低抗原、易吸收的特点，低肽甚至比氨基酸更易吸收，因而引起了当今食品界和医学界的广泛重视，是目前研究最活跃的领域之一[16]。本试验中采用固相萃取技术分离纯化板蓝根中的内源性肽，结合Nano-LC-MS/MS鉴别出了200左右的肽段[17]，氨基酸序列主要分布在4～30之间，BCA法测定肽的含量在60%以上。

根据测试结果，样品对超氧阴离子试验没有明显作用，对照品Vc作为经典的优良抗氧化剂，对超氧阴离子试验作用同样较弱。样品和对照品Vc对DPPH自由基和羟基自由基的清除均有良好的作用，有一定的“量-效”关系，整体上样品的抗氧化能力较Vc稍弱；但在铁离子还原力(FRAP)的试验中，样品的吸光度较Vc组高，由于FRAP不是针对某一种自由基清除能力，而是样品总的还原能力，可用来反应样品总的抗氧化活性，说明样品的整体还原力强于对照组Vc。

板蓝根在临床上主要用于病毒和细菌感染性疾病。病原微生物感染宿主后，引起氧化应激，如活性氧自由基(ROS)。生理状态机体维持着ROS的平衡，当微生物感染后，产生的ROS超出机体的清除能力，过量产生的氧自由基的毒性和反应性介导了宿主对病毒复制的器官或组织的免疫反应过度，诱发细胞因子风暴，从而加重疾病进程，是引起炎症的致病机制之一。研究最广泛的活性氧包括超氧阴离子(O2-)、羟基自由基(·HO)和过氧化氢(H2O2)[18-20]。因此，研究药物的抗氧化活性，在一定程度上可以反应出对炎症反应的抵抗作用。由于体外测试简单、快速，可有效快速的筛选抗炎、抗氧化活性药物，也能阐明药物的作用机制。

本课题组前期研究发现，板蓝根中蛋白(多肽)总量可达到6%～10%[6-7]，体内外研究表明，蛋白经胃肠道消化后，降解为肽发挥其抑制肺部炎症和促进T细胞和B细胞的增殖的作用[8-9]。本研究涉及的板蓝根的内源性肽有良好的抗氧化作用，以此减轻或抑制病原微生物引起的炎症反应，与板蓝根外源性的消化肽协同作用可能是其“清热解毒”的机制之一，均是发挥调节机体生理功能的重要因素，该方面的研究应引起重视。