一个灵芝新品种的选育与分子鉴定*

丛倩倩，崔 晓，唐丽娜，李秀梅，安秀荣

（泰安市农业科学院，山东 泰安 271000）

灵芝（Ganoderma lingzhi）属真菌界（Fungi）担子菌亚门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）灵芝科（Ganodermataceae）灵芝属（Ganoderma），是一种名贵的药用真菌，具有抗肿瘤、护肝、抗病毒、抑菌、抗氧化等多种药效[1-5]，被称为“仙草”。

近年来，随着灵芝药用功效被不断发现，人们对灵芝及其产品的需求量大幅增加，灵芝产业化、规模化发展迅速[6-7]。我国是灵芝出口大国，但栽培品种大多由国外引进或野生菌株分离得到，具有自主知识产权的品种较少[8]。这不仅对我国灵芝产业的发展构成威胁，还会对其他国家的品种产生依赖性，同时也浪费了我国丰富的灵芝种质资源。此外，大多育种的目标更注重产量因素而忽视了功能性指标，导致有效成分含量高的品种较少，且菌种退化的现象比较严重，这些问题均制约了我国灵芝产业的发展[9]。因此，选育具有自主知识产权且有效成分含量高的优质高产新品种，提高品种的功能性，对满足国民营养健康需求，加快推进供给侧结构优化和品种换代改良具有重大意义，是促进我国灵芝产业健康发展的重要基础。

以国家认定品种泰山赤灵芝1号（TL-1）和野生灵芝菌株4895作为亲本，通过原生质体单核化杂交育种技术开展灵芝新品种的选育工作，旨在为灵芝生产提供优质高产的新菌株，提升产品的市场竞争力。

1 材料与方法

1.1 供试材料

亲本菌株TL-1、4895于泰安市农业科学院食用菌研究所保藏。TL-1为国家认定品种，子实体多糖含量较高，综合农艺性状较好；4895由采自泰山的野生灵芝菌株驯化而来，其子实体三萜含量较高。

1.2 亲本原生质体的制备与再生

分别制备2个亲本的原生质体，用液体再生培养基适当稀释后涂布于固体再生培养基平板上，至长出再生菌落[10-11]。

1.3 单核菌株的筛选及交配型测定

从亲本原生质体再生平板上挑取菌落小、生长缓慢的单菌落，分别转接到PDA培养基中，待菌落长至3 cm～5 cm时，挑取边缘菌丝镜检，无锁状联合的即为单核菌株。随机选取一株单核菌株作为标准菌株，将其他单核菌株分别与该标准菌株接种到同一个PDA培养基平板上进行对峙培养，当2个菌株的菌丝相互接触后，挑取交接处菌丝镜检。有锁状联合则说明这2个单核菌株为不同的交配型；无锁状联合则说明两者不亲和，为相同的交配型。

1.4 杂交菌株的选育过程

用直径0.5 cm的金属打孔器分别将具有不同交配型的2个单核菌株接种到同一个PDA培养基平板上，两者相距2 cm，25℃恒温箱对峙培养7 d；待菌丝相互接触后，挑取交接处的菌丝镜检，有锁状联合则说明杂交成功；将杂交成功组合进行拮抗反应验证，共获得杂交菌株5个。2018年，将5个杂交菌株分别进行栽培比较试验，发现编号为TL-3的杂交菌株菌盖中等偏大且厚，形态较饱满，产量、子实体有效成分含量均高于亲本菌株TL-1。2019年至2021年，进行了连续3年的栽培试验，发现TL-3菌株遗传稳定性较好，综合农艺性状优良，具有较高的应用推广价值。

1.5 优良菌株的ISSR分子标记鉴定

分别提取亲本菌株TL-1、4895和杂交菌株TL-3的菌丝体基因组DNA[12]，参考NY/T 1730-2009食用菌菌种真实性鉴定ISSR法[13]中推荐的28条引物分别对供试菌株进行ISSR-PCR扩增。PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，根据扩增条带的稳定性和多态性筛选出适合用于ISSR分析的引物。从筛选出的适宜引物中挑选扩增效果较好的引物作为ISSR分子标记验证优良杂交菌株的引物。

1.6 优良菌株的菌丝生长特征分析

取大小约0.5 cm×0.5 cm的亲本和杂交株的菌丝块，分别接种于3个PDA平板培养基上，置于25℃恒温箱中避光培养5 d；观察亲本和杂交株的菌落形态，并测量菌丝的生长速度，每个处理3次重复。

1.7 优良菌株的综合农艺性状分析

发菌期，观察和记录亲本和杂交菌株的栽培袋菌丝生长情况。子实体生长期，拍照记录不同生长时期的子实体形态特征。待菌盖边缘白色生长点消失，菌盖背面开始弹射雾状红褐色孢子时，开始采收。采收后，亲本和杂交菌株各取30个灵芝子实体，分别测量菌盖长直径、菌盖厚度、菌柄长度；将子实体晒干，统计产量并计算生物学效率，生物学效率为子实体干重（g）与培养料干重（g）之比乘以100%，每个处理3次重复。

1.8 优良菌株的有效成分含量检测

各取10个晒干的灵芝子实体，分别检测亲本和杂交株子实体中多糖和三萜的含量[14-15]，每个处理3次重复。

1.9 数据分析

采用DPS软件对以上数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 亲本原生质体的制备与再生

亲本菌丝体通过溶壁酶降解除去细胞壁后，离心收集原生质体，并在显微镜下分别拍照记录原生质体的形态，见图1。

图1 亲本菌株TL-1及4895的原生质体Fig.1 Protoplasts of parental strains TL-1 and 4895

2.2 单核菌株的筛选及交配型测定

通过镜检亲本原生质体再生菌落中锁状联合的有无，可以筛选到2种交配型的单核菌株。筛选获得TL-1单核菌株共21个，其中2种不同交配型单核体的比例为16∶5；筛选获得4895单核菌株23个，其中仅获得1种交配型单核体。

2.3 优良杂交菌株的鉴定

对菌株进行拮抗试验，结果见图2。

图2 亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3的拮抗现象Fig.2 Antagonism of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

如图2所示，杂交菌株TL-3与亲本菌株TL-1、4895之间均存在明显的拮抗现象，证明TL-3为真正的杂交株。

菌株TL-1、4895和TL-3的ISSR扩增图谱见图3。

图3 亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3的ISSR扩增图谱Fig.3 ISSR amplification map of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

如图3所示，ISSR分子标记验证中，引物P4、P9对杂交株和亲本菌株的扩增效果较好，亲本菌株与杂交株间的特异性条带较明显。杂交株TL-3扩增条带中同时包含了亲本菌株TL-1和4895的特异性条带，从而在分子水平上进一步证明了TL-3杂交株的真实性。

2.4 优良菌株的菌丝生长特性分析

对亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3进行培养，其菌落形态见图4，菌丝生长情况见表1。

由图4和表1可知，杂交菌株TL-3菌丝洁白，呈绒毛状，浓密，长势强壮。TL-3平板培养的菌丝生长速度介于2个亲本之间，为0.74 cm·d-1，快于亲本菌株4895，慢于亲本菌株TL-1，与2个亲本菌株相比差异极显著（P<0.01）。

表1 亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3的菌丝生长情况比较Tab.1 Comparison of mycelial growth between parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

图4 亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3的菌落形态Fig.4 Mycelial morphology of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

2.5 优良菌株的综合农艺性状分析

统计亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3的农艺性状，结果见表2。

由表2可知，TL-3栽培袋中菌丝的发菌速度为0.62 cm·d-1，介于2个亲本之间；菌丝长势强壮、浓密，发菌情况与双亲相比均无显著性差异。菌盖中等偏大，平均长直径为10.33 cm，小于2个亲本菌株，与亲本TL-1之间有显著性差异（P<0.05），与4895之间无显著性差异。TL-3菌盖厚度为2.79 cm，比双亲的菌盖厚，与TL-1之间差异极显著（P<0.01），与4895之间无显著性差异。TL-3菌柄长度为2.06 cm，短于双亲，但无显著性差异。TL-3平均单产和生物学效率比2个亲本菌株高，与亲本TL-1之间有显著性差异（P<0.05），与4895之间无显著性差异。

表2 亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3的农艺性状比较Tab.2 Comparison of agronomic characters between parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

对比亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3不同生长时期的子实体形态，结果见图5（左侧图为正面，右侧图为背面）。

图5 亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3不同生长时期的子实体正反面形态Fig.5 Positive and negative morphology of fruit bodies of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3 at different growth stages

如图5所示，TL-3子实体肾圆形，正面黄褐色到红褐色，有光泽，表面有明显的放射性纵脊和同心环纹，反面黄色，菌盖边缘较圆钝；菌肉淡褐色；菌柄扁圆柱状，光滑且亮，红褐色至紫褐色。

2.6 优良菌株的有效成分含量检测

检测亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3的多糖、三萜含量，结果见表3。

表3 亲本菌株TL-1、4895及杂交株TL-3子实体有效成分含量比较Tab.3 Comparison of effective components in fruit bodies of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

由表3可知，杂交菌株TL-3子实体多糖含量为1.09%，均高于亲本，比TL-1提高1.87%，比4895提高29.76%，与亲本TL-1之间无显著性差异，与亲本4895之间有极显著差异（P<0.01）。子实体三萜含量为0.22%，介于2个亲本之间，比亲本菌株TL-1提高37.5%，与2个亲本之间均有极显著性差异（P<0.01）。

2.7 优良菌株的遗传稳定性分析

将杂交株TL-3进行连续3年的栽培试验，并记录每年的栽培农艺性状，统计结果见表4。

表4 杂交株TL-3的遗传稳定性分析Tab.4 Genetic stability analysis of hybrid strain TL-3

由表4可知，杂交株TL-3菌丝生长速度为0.60 cm·d-1～0.65 cm·d-1，平均单产为 40.5 g/袋～43.7 g/袋，生物学效率>6%，子实体中多糖和三萜的含量分别为1.07%～1.13%和0.21%～0.27%。每年的栽培农艺性状之间及与初代之间在平均生长速度、平均单产、生物学效率、子实体多糖及三萜含量等方面基本一致，说明杂交菌株TL-3遗传稳定性较好。

3 讨论

亲本TL-1为国家认定品种，其综合农艺性状较好，子实体多糖含量较高，但三萜含量较低；且TL-1作为主栽品种之一，经过连续多年的栽培，菌种退化现象比较严重。亲本4895子实体片厚且三萜含量较高，但产量低。经原生质体单核化杂交选育的新品种TL-3较好地遗传了双亲的优良性状，其出芝整齐、片厚、产量高、子实体多糖和三萜含量均较高，综合农艺性状和功能性指标均优于国家认定品种TL-1，具有较高的推广应用价值。此外，新品种的选育还有效解决了菌种退化问题，为生产企业替换老化、退化的品种提供了备选种质资源，进一步满足了市场需求。

通过分别提取亲本和新品种的基因组DNA，利用ISSR法，从28条引物中筛选出2条扩增效果较好的引物作为ISSR分子标记验证杂交菌株的引物。进一步从分子水平上证明了新品种的真实性，为将来申报新品种权提供了依据。