柴芩双解汤对急性胰腺炎所致大鼠肺损伤的保护作用机制

毛 焕 潘建立 王长友

天津市蓟州区人民医院1.病理科；2.普外科，天津 301900

急性胰腺炎是一种全身性疾病，肺损伤是其发病后首先出现的严重并发症[1］。急性胰腺炎肺损伤患者主要表现为胸腔积液、动脉血氧分压（PaO2）降低等症状，是影响胰腺炎进展及预后的关键性因素[2］。中医学认为胰腺炎肺损伤与体内肝火瘀滞、气滞湿阻等病机有关[3］，然而目前临床中尚未有用于治疗急性胰腺炎肺损伤的疗效确切的药物，对于急性胰腺炎所致肺损伤的治疗药物的研发，仍是目前的工作重点。Rho/ROCK通路近年来被报道是诱导胰腺炎患者体内发生炎症因子级联反应的重要信号通路[4］，并对胰腺炎肺损伤患者的疾病状态发挥重要作用[5］。柴芩双解汤由柴胡、葛根等诸多中药材组成，具有清热解毒、和解表里的功效。本研究通过探索柴芩双解汤对急性胰腺炎所致大鼠肺损伤的保护作用及机制，为柴芩双解汤在急性胰腺炎所致肺损伤中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠72只，雄性，SPF级，8周龄，体质量250～300 g，购自湖南嘉泰实验动物有限公司[许可证号：SCXK（湘）2020-0006］，饲养于动物房，温度20～24℃，湿度40%～70%，每12 h明暗交替，给予标准饲料及自来水。

1.1.2 药品及试剂 柴芩双解汤（由柴胡4.5 g，生葛根3 g，羌活2.4 g，知母6 g，炙草3 g，青子芩4.5 g，生石膏四钱12 g，防风3 g，猪苓4.5 g，白豆蔻1.8 g组成）由药材饮片制成生药含量为1 g/mL的汤剂，由北京同仁堂药业提供；牛黄胆酸钠（北京索莱宝科技公司，货号145-42-6）；法舒地尔注射液（天津红日药业股份有限公司，批号201905261，规格2 mL：30 mg）；肺组织髓过氧化物酶（MPO）（武汉菲恩生物科技有限公司，货号ER0142）；环氧化酶2（COX-2）（武汉华美生物工程有限公司，货号CSBE13399r-1）；一氧化氮合酶（iNOS）（江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGT020）；RhoA、GAPDH兔单克隆抗体及ROCK2兔多克隆抗体（碧云天生物科技公司，货号AF2179、AF1186、AF7899）；蛋白裂解液（德国Qiagen公司，货号19076）；显影液（上海博湖生物科技有限公司，货号BH-DB6589）；苏木精伊红（HE）染色液（上海吉至生化科技有限公司，货号AG1120）；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物设计及合成（赛默飞世尔科技有限公司）；TRIzol试剂及qPCR试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司，货号A15299、A33254）。

1.1.3 仪器 InfiniteF50酶标仪（瑞士Tecan公司）；MicroChemi凝胶成像仪（以色列DNR生物影像系统有限公司）；Ts2-FL荧光倒置显微镜（尼康仪器有限公司）；RM2235石蜡切片机（德国Leica公司）；冷冻离心机购自美国BECKMAN COULTER公司；BX-4000全自动生化分析仪购自日本SYSMEX公司；VetStat动物电解质与血气分析仪（美国IDEXX公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组 72只大鼠随机分为假手术组，胰腺炎肺损伤组，柴芩双解汤低、中、高剂量组及法舒地尔组，每组12只。除假手术组，其余参照文献方法[6-7］，大鼠麻醉后取仰卧位，沿腹部中线行纵向切口，暴露十二指肠，按照1 mL/kg向胰胆管泵入5%牛黄胆酸钠；假手术组只暴露十二指肠及胰胆管然后关腹。2 d后以大鼠食欲减退、毛色变暗、背部弓起、耳缘静脉变粗突起，同时伴呼吸急促，肺部听诊出现湿啰音视为造模成功[7］，所有大鼠全部造模成功，造模成功率100%。按照临床给药剂量的6.2倍折算，柴芩双解汤低、中、高剂量组分别灌胃给予2、4、8 g/kg的柴芩双解汤，每日2次；法舒地尔组腹腔注射法舒地尔10 mg/kg[8］，每日1次；假手术组及胰腺炎肺损伤组给予生理盐水，连续5 d[9］。

1.2.2 血PaO2、二氧化碳分压（PaCO2）检测 大鼠麻醉后仰卧，固定于操作板上，腹主动脉取血3 mL，使用血气分析仪检测大鼠动脉血PaO2、PaCO2。

1.2.3 肺组织MPO、COX-2、iNOS检测 大鼠处死后取肺组织，研磨匀浆后离心，取上清，使用MPO、COX-2、iNOS ELISA检测试剂盒测定肺组织MPO、COX-2、iNOS水平。

1.2.4 病理学评价 取肺组织，经生理盐水灌洗后用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切成5µm厚的切片，HE染色，光镜下盲法观察。根据肺组织水肿、出血、炎症细胞浸润等病理改变比例进行Holfbauer病理评分[10］，0分：无病理改变；1分：0<病理改变≤25%；2分：25%<病理改变≤50%；3分：50%<病理改变≤75%；4分：75%<病理改变≤100%。

1.2.5 肺组织RhoA、ROCK2 mRNA水平检测 用TRIzol试剂从肺组织中提取总RNA，用逆转录酶试剂盒合成cDNA。使用qPCR试剂盒进行qRT-PCR检测，以GAPDH作为内参，使用2−ΔΔCT法分析各基因相对表达量。引物序列如表1所示。

表1 各基因引物序列

1.2.6 肺组织RhoA、ROCK2蛋白表达检测 取肺组织，用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液裂解并匀浆，以8 000 r/min离心10 min，收集上清液，水浴煮沸变性后测蛋白浓度，取50µg蛋白上样，电泳分离、转膜后，用RhoA、GAPDH兔单克隆抗体及ROCK2兔多克隆抗体（均以1∶500稀释）及山羊抗兔二抗（1∶1 000稀释）孵育后，滴加显影剂，凝胶成像并使用ImageJ进行定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示，对多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠血PaO2、PaCO2的影响

与假手术组比较，胰腺炎肺损伤组大鼠血PaO2降低，血PaCO2升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与胰腺炎肺损伤组大鼠比较，柴芩双解汤低、中、高剂量组及法舒地尔组大鼠血PaO2升高，血PaCO2降低，且随着柴芩双解汤剂量的增加，大鼠血PaO2逐渐升高，PaCO2逐渐降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。详见表2。

表2 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠血PaO2、PaCO2的影响（mmHg）

2.2 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠肺组织MPO、COX-2、iNOS的影响

与假手术组比较，胰腺炎肺损伤组大鼠肺组织MPO、COX-2、iNOS水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与胰腺炎肺损伤组大鼠比较，柴芩双解汤低、中、高剂量组及法舒地尔组大鼠肺组织MPO、COX-2、iNOS水平降低，且MPO、COX-2、iNOS水平随柴芩双解汤剂量的增加而逐渐降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。详见表3。

表3 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠肺组织MPO、COX-2、iNOS的影响（U/g）

2.3 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠肺组织病理的影响

假手术组大鼠肺组织正常，与假手术组大鼠比较，胰腺炎肺损伤组肺泡壁增厚，肺间质水肿及炎性细胞浸润，肺组织病理评分显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与胰腺炎肺损伤组大鼠比较，柴芩双解汤低、中、高剂量组及法舒地尔组大鼠肺组织炎性浸润减轻，肺泡壁增厚减轻，病理学评分降低，差异有统计学意义（P<0.05）。详见图1及表4。

表4 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠肺组织病理评分的影响

图1 柴芩双解汤对急性胰腺炎所致大鼠肺损伤的影响

2.4 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠RhoA、ROCK2 mRNA的影响

与假手术组比较，胰腺炎肺损伤组大鼠肺组织RhoA、ROCK2 mRNA水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与胰腺炎肺损伤组大鼠比较，柴芩双解汤低、中、高剂量组及法舒地尔组大鼠RhoA、ROCK2 mRNA水平降低，且RhoA、ROCK2 mRNA水平随柴芩双解汤剂量的增加而逐渐降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。详见表5。

表5 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠RhoA、ROCK2 mRNA的影响

2.5 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠RhoA、ROCK2蛋白表达的影响

与假手术组比较，胰腺炎肺损伤组大鼠肺组织RhoA、ROCK2蛋白水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与胰腺炎肺损伤组大鼠比较，柴芩双解汤低、中、高剂量组及法舒地尔组RhoA、ROCK2蛋白水平降低（P<0.05），随着柴芩双解汤剂量的增加，大鼠肺组织RhoA、ROCK2蛋白水平逐渐降低，差异有统计学意义（P<0.05）。详见图2。

图2 柴芩双解汤对急性胰腺炎肺损伤大鼠RhoA、ROCK2蛋白表达的影响

3 讨论

急性胰腺炎是临床常见的消化道危重症之一，由酒精性因素、代谢性疾病等病因导致胰酶在胰腺内被激活并消化自身胰腺组织，引起胰腺水肿、出血甚至坏死等炎症反应。流行病学研究表明，急性胰腺炎发病率逐年上升，总体病死率约为5%[11］，若患者出现呼吸功能受限等肺部相关并发症则提示预后不良[12］，因此对于急性胰腺炎肺损伤的治疗非常关键。

中医学认为胰腺炎是以痞结于胸、肝气郁滞、腑实不通等为主要病机，其临床表现的腹痛、发热等症状则归属为“痞、满、燥、实”的典型表现[13］。因此对于胰腺炎及其引起的肺损伤等并发症则采用清热泻火、祛瘀通腑的原则进行治疗[14］。柴芩双解汤出自中医学著作《重订通俗伤寒论》，具有和解表里，调剂阴阳之功效，传统中医学使用其治疗肢冷胁痛、胸痞不舒等症状。方中柴胡、黄芩为君药，起到清少阳相火之功效；葛根、羌活、防风则为臣药，用于解表祛邪；同时知母、石膏联合黄芩，使邪离于阳，佐以猪苓，分离阴阳；使以白蔻之开达气机，最后以甘草调和各药。

动脉血PaO2水平及PaCO2水平是反映肺换气功能的重要指标[15-16］。MPO是由中性粒细胞分泌的一种过氧化物酶，在胰腺炎患者体内，过度活化中性粒细胞分泌的MPO能够促进毛细血管通透性增加，进而使肺组织充血、水肿，渗出增加，临床表现为胸腔积液等[17］。COX-2是胰腺炎发病过程中影响预后的重要因子，研究发现，胰腺炎大鼠体内COX-2表达显著升高，敲除胰腺炎小鼠COX-2基因后，小鼠肺损伤则明显减轻[18］。临床试验表明，给予胰腺炎患者COX-2抑制剂，可显著降低患者重症胰腺炎的发生率[19］。刘垒等[20］研究发现，iNOS水平升高是胰腺炎肺损伤的发病原因之一。朱斌等[21］研究表明，抑制肺组织iNOS水平能够减轻胰腺炎肺损伤。本研究发现，给予大鼠柴芩双解汤后，与胰腺炎肺损伤组比较，大鼠血PaO2升高，PaCO2降低，肺组织MPO、COX-2、iNOS水平呈剂量依赖性降低，大鼠肺组织病理学评分逐渐降低，提示柴芩双解汤能够恢复胰腺炎肺损伤大鼠肺功能并降低其炎症反应。

Rho/ROCK通路是与细胞迁移、粘附和聚集相关的信号通路。研究表明，其在体内异常激活能够促进下游与炎症相关通路蛋白的表达[22］。有文献报道，Rho/ROCK通路异常与肿瘤、蛛网膜下腔出血、肺动脉高压、肺纤维化等疾病有密切关系[23］。Rho/ROCK通路对胰腺淀粉酶、蛋白酶等多种酶的分泌有重要影响。同时，在胰腺炎患者体内，Rho/ROCK通路被激活，可促进趋化因子的形成，加速中性粒细胞等炎症细胞浸润，诱发炎症因子瀑布反应，导致患者疾病加重[24］。抑制Rho/ROCK通路的过度表达则能够起到肺损伤保护作用[25］。法舒地尔是临床中常用的一种Rho/ROCK通路抑制剂，因此本实验使用法舒地尔作为阳性对照药物。本实验表明，与胰腺炎肺损伤组大鼠比较，柴芩双解汤各剂量组及法舒地尔组大鼠肺组织RhoA、ROCK2 mRNA及蛋白水平呈剂量依赖性降低，提示柴芩双解汤对胰腺炎肺损伤大鼠的保护作用及肺组织病理改变的修复作用可能是通过调节Rho/ROCK通路实现的。

综上所述，柴芩双解汤能够改善急性胰腺炎所致肺损伤大鼠肺功能并抑制肺组织病理性改变，降低炎症水平及氧化损伤，其机制可能与调节Rho/ROCK通路有关。

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