视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的机制研究

令狐绍容 罗泓扬

糖尿病视网膜病变(DR)是我国人群致盲的主要原因之一[1]。视网膜色素上皮(RPE)细胞因受到高糖环境的影响，通过分泌各种因子和信号分子影响神经节细胞、光感受器细胞、周细胞和血管内皮细胞，从而有助于DR进展[2]。玻璃体视网膜交界处纤维血管性视网膜前膜生长所致的视网膜前新血管生成和细胞外间质扩张是增生型糖尿病视网膜病变(PDR)的主要特征，而人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)发生内皮细胞间充质转化(EndoMT)在其中发挥的作用不可忽视[3-4]。转化生长因子β(TGF-β)超家族已被证明是EndoMT的重要调节因子[5-7]。

外泌体是一类直径为50～150 nm的微小囊泡，可由不同类型的细胞分泌，包含mRNA、微小RNA(miRNA)、蛋白质和其他信号分子，被认为是细胞间通讯的重要介质[8-9]。然而，释放外泌体的细胞类型以及它们的目标仍然是未知的。本研究通过分析人RPE细胞系ARPE-19细胞分泌的外泌体中miR-4488的表达对HRMECs增殖、迁移和血管生成的影响，来确定其在EndoMT中的潜在作用，希望为寻找PDR的有效治疗靶点提供证据支持。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及主要试剂、仪器ARPE-19细胞和HRMECs均购自美国ATCC微生物菌种保藏中心；Dulbecco改良鹰氏培养基/Ham’s F-12营养混合物(DMEM/F-12)购自美国Sigma-Aldrich公司；内皮细胞基础培养基-2(EBM-2)购自美国Lonza公司。PKH67荧光试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司。鼠抗CD63(货号：ab59479)、兔抗CD9(货号：ab92726)、兔抗HSP70(货号：ab79951)、兔抗β-actin(货号：ab8227)、兔抗TGF-β受体Ⅱ(TGFβR2)(货号：ab186838)、鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(货号：ab7817)购自英国Abcam公司；兔抗p-Smad2ser467(AF3449)、兔抗Smad2(AF6449)、兔抗Desmin(AF7013)购自江苏Affinity公司。CCK-8试剂购自美国Sigma公司；Trizol试剂、PrimeScriptRTMaster Mix试剂盒购自大连宝生物有限责任公司；TaqMan miRNA芯片(含有754个miRNAs)购自美国Thermo公司；委托上海GenePharma公司克隆野生型和突变型(MUT1～MUT4)TGFβR2-3’-UTR荧光素酶报告载体(pmirGLO-TGFβR2-3’-UTRwt和pmirGLO-TGFβR2-3’-UTRmut)。JEM-1230型透射电子显微镜购自日本JEOL公司。ABI 7500热循环仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组将ARPE-19细胞、HRMECs分别置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基或EBM-2培养基中，于含体积分数5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养。选择第5代至第10代细胞用于实验。将ARPE-19细胞随机分为空白组、高糖组。将HRMECs随机分为NG组、HG组、NG+外泌体组和HG+外泌体组。空白组、NG组和NG+外泌体组细胞用含5.5 mmol·L-1正常浓度葡萄糖的培养基培养24 h；高糖组、HG组和HG+外泌体组细胞用含30 mmol·L-1高浓度葡萄糖的培养基培养24 h；NG+外泌体组和HG+外泌体组细胞在培养基中分别加入空白组或高糖组培养的ARPE-19细胞分泌的外泌体40 μg·L-1。

1.2.2 外泌体纯化和鉴定取空白组和高糖组ARPE-19细胞，在无血清培养基中培养72 h后，以2000 r·min-1离心10 min，10 000 r·min-1离心30 min，经0.22 μm微型过滤器过滤。采用超速离心法，在4 ℃以120 000 r·min-1超速离心70 min，用0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，透射电镜下观察。用纳米颗粒追踪仪分析粒子直径和分布。Western blot检测外泌体特征标志物CD63(1200)、CD9(1150)和HSP70(1200)的表达。

1.2.3 PKH67绿色荧光标记分别取空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体颗粒，用PKH67(1 μmol·L-1)染色，不含外泌体的混合物用作阴性对照，37 ℃下培养5 min后，使用ExoQuick-TC收集外泌体。用鬼笔环肽-iFluro594对用EBM-2培养基(含体积分数1%去除外泌体的胎牛血清)培养的NG组和HG组HRMECs染色，然后与PKH67标记的外泌体在37 ℃下孵育24 h，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核。共焦显微镜下观察HRMECs对外泌体的摄取。

1.2.4 细胞迁移和促血管形成实验将HRMECs(1×105个细胞)置于Transwell小室下层，分组处理后，用200 mL移液枪头尖端划出一道均匀痕迹。Transwell小室上层加入同样葡萄糖培养基的ARPE-19细胞，在0 h和24 h时捕捉图像。伤口距离是从至少3个随机选择的区域测量的。另外，将Transwell小室下层涂抹250 μL 10 g·L-1基质凝胶后接种HRMECs，分组处理后，同上方法处理细胞，培养6 h后，显微镜下观察，并用Imagepro plus软件扫描血管结点数和血管总长度。

1.2.5 细胞增殖实验将HRMECs按每孔3×103个接种到96孔板中，过夜培养，分组处理后，加入CCK-8试剂孵育1 h，记录各组细胞在450 nm波长的光密度。

1.2.6 miRNA微阵列分析取空白组和高糖组ARPE-19细胞外泌体，用Trizol试剂提取总RNA，用PrimeScriptRTMaster Mix试剂盒合成cDNA。采用TaqMan miRNA芯片对2组ARPE-19细胞进行miRNA表达谱分析。用DataAssist v3.01软件进行数据分析。实时荧光定量PCR检测目标基因表达，用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量，U6作为miRNA的小分子内参。为了进一步验证miR-4488相对表达量，使用RiboTMmRNA/lncRNA qRT-PCR Starter试剂盒和ABI 7500热循环仪对cDNA进行PCR扩增。最终反应体系为20 μL，反应条件为94 ℃预变性5 min，1个循环；94 ℃变性30 s，55～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环。引入序列如下：miR-4488正向引物为5’-AGGGGGCGGGCUCCGGCG-3’，反向引物为5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；U6 mRNA正向引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’。

1.2.7 miR-4488靶标预测及双荧光素酶报告分析miR-4488靶标预测和分析采用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、 miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和miRanda(http://www.microrna.org/)在线工具进行。发现了4个潜在的结合位点。为了确定 miR-202-5p与TGFβR2基因周围序列的结合特异性，在HEK293T细胞中进行了双荧光素酶报告实验。将细胞接种到24孔板中，用脂质体法将20 pmol miR-4488模拟物或对照模拟物与800 ng TGFβR2wt或TGFβR2mut共转染，分为miR-4488模拟物+TGFβR2wt组、miR-4488模拟物+TGFβR2mut组、对照模拟物+TGFβR2wt组、对照模拟物+TGFβR2mut组。转染48 h后洗涤细胞，用双荧光素酶报告基因分析系统测定细胞内荧光素酶活性。

1.2.8 Western blot检测TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467蛋白表达取各组HRMECs，用含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液对外泌体颗粒或细胞进行酶解提取总蛋白。取等量蛋白装载到凝胶上，经电泳分离后，将目的条带转移到聚偏氟乙烯膜上。然后与初级抗体在室温下孵育1 h或在4 ℃条件下孵育过夜，然后将膜洗净，与适量辣根过氧化物酶结合的二抗在室温下孵育1 h。使用增强的化学发光系统可视化标记的特定蛋白，记录TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467蛋白相对表达量。

1.2.9 免疫荧光染色观察Desmin和α-SMA表达取各组HRMECs在玻璃盖玻片上贴壁生长，用40 g·L-1多聚甲醛固定过夜，然后用含体积分数5%正常山羊血清、体积分数0.1% Triton X-100的1×PBS在室温下阻断1 h，加入Desmin和α-SMA一抗于 4 ℃ 孵育过夜，加入二抗，用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(1500)反染细胞核，共聚焦显微镜(TCS SP8)下拍摄图像并分析。

1.3 统计学分析应用SPSS 19.0软件包对各组数据进行统计学分析。所有实验均重复3次，数据结果均以均数±标准差表示，进行单因素方差分析和Bonferroni或Dunnettt检验两两比较。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 ARPE-19细胞分泌外泌体的鉴定透射电镜下观察可见，所提取的颗粒形态为圆形(图1A)。经纳米颗粒追踪仪分析，空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体直径分别为(96.8±4.6)nm和(95.4±3.5)nm,直径范围均为 50～150 nm，两组ARPE-19细胞分泌的外泌体直径相比差异无统计学意义(P>0.05)；空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体浓度分别为(3.78×1012±1.03×1011)个·mL-1和(5.35×1012±1.07×1011)个·mL-1，高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体浓度略高于空白组(P<0.05)(图1B)。Western blot检测结果显示，这些颗粒存在外泌体特征标记，包括CD63、CD9、HSP70蛋白表达阳性(图1C)。

图1 空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体的鉴定 A：透射电镜下观察结果；B：纳米颗粒追踪分析； C：Western blot检测外泌体标志蛋白表达。1：NG组；2：HG组。

2.2 HRMECs对ARPE-19细胞分泌外泌体的吸收空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体被PKH67标记后加入EBM-2培养基,都可被其内培养的HRMECs吸收(图2)。

图2 荧光分析检测NG组和HG组HRMECs(蓝色)可吸收PKH67标记(绿色)的ARPE-19细胞分泌的外泌体

2.3 ARPE-19细胞分泌的外泌体对HRMECs增殖、迁移和血管生成的影响与NG组相比，HG组HRMECs细胞光密度由0.673±0.044增加至0.786±0.051，细胞迁移率由45.57%±4.30%增加至67.22%±6.50%，血管结点数由(9±2)个增加至(29±5)个，血管总长度由(7250±332)μm增加至(15 000±582)μm，两组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与HG组相比，HG+外泌体组HRMECs细胞光密度、细胞迁移率、血管结点数和血管总长度分别减少至0.720±0.033、59.30%±3.17%、(20±3)个和(10 500±579)μm(均为P<0.05)；NG+外泌体组HRMECs细胞光密度、细胞迁移率、血管结点数和血管总长度分别为0.668±0.043、43.26%±4.09%、(8±2)个和(7025±405) μm，与NG组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

2.4 miRNA微阵列分析与空白组相比，高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体颗粒中36个miRNA表达上调，包括miR-4488、miR-199b-5p和miR-708-5p；有70个miRNA表达下调(图3)。其中miR-4488上调最明显(变化倍数超过20倍)。利用qRT-PCR验证，与空白组相比，高糖组ARPE-19细胞外泌体中miR-4488相对表达量分别由1.00±0.08增加至1.45±0.10。

图3 ARPE-19细胞分泌的外泌体miRNAs微阵列确定候选miRNA的火山图

2.5 HRMECs中TGF/Smad信号通路变化与NG组相比，HG组HRMECs中TGFβR2、p-Smad2ser467蛋白相对表达量分别由1.011±0.150、0.468±0.072增加至2.985±0.117、1.226±0.085(均为P<0.05)，而与HG组相比，HG+外泌体组HRMECs中TGFβR2、p-Smad2ser467蛋白相对表达量降低至1.705±0.106、1.014±0.051(均为P<0.05)。NG+外泌体组HRMECs中TGFβR2、p-Smad2ser467蛋白相对表达量分别为0.985±0.147、0.501±0.100，与NG组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。Smad2蛋白相对表达量4组间相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)(图4)。

图4 Western blot检测各组TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467蛋白表达

2.6 miR-4488靶基因预测及生物信息学分析结果经在线工具检索，TGFβR2的3’UTR区域含有2个miR-4488的结合位点(图5)，经双荧光素酶报告实验验证，与对照模拟物+TGFβR2wt组相比，miR-4488模拟物+TGFβR2wt组2个位点的双荧光素酶活性由1.00±0.081、1.00±0.083分别降低至0.512±0.044、0.623±0.064(均为P<0.05)，而与对照模拟物+TGFβR2mut组2个位点的双荧光素酶活性(1.01±0.07、1.00±0.07)相比，miR-4488模拟物+TGFβR2mut组双荧光素酶活性基本不变,分别为0.97±0.10、0.98±0.10,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

图5 TGFβR2的3’UTR区域miR-4488的结合位点预测

2.7 ARPE-19细胞分泌的外泌体通过miR-4488调节HRMECs EndoMT进程与NG组(设为1.00)相比，HG组HRMECs的间充质表型标志物Desmin和α-SMA蛋白荧光强度均明显增加，分别为37.12±4.70和9.82±1.74,差异均有统计学意义(均为P<0.05)；而与HG组相比，HG+外泌体组HRMECs细胞中Desmin和α-SMA蛋白荧光强度均降低，分别为11.30±2.13和0.50±0.46，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。此外，NG+外泌体组HRMECs中Desmin和α-SMA蛋白荧光强度与NG组相比基本一致，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(图6)。

图6 免疫荧光染色检测各组HRMECs中Desmin和α-SMA蛋白表达

3 讨论

RPE层主要介导视网膜感光细胞和绒毛膜毛细血管之间的联系，为视网膜提供结构性支持，也有助于视网膜的完整性、新陈代谢和功能维持[3,10-11]。有研究表明，RPE细胞在高糖条件下表现为早期功能障碍，随后出现光感受器细胞和内皮细胞损伤[11]。在本研究中，我们发现高糖组ARPE-19细胞能够分泌大量的含有miR-4488的外泌体，而miR-4488可进一步通过靶向TGFβR2的3’UTR，减缓或抑制了高糖诱导的HRMECs的EndoMT进程。

高糖可诱导毛细血管变性，如血-视网膜屏障损伤或渗漏和细胞增殖，导致视网膜新生血管形成。肿瘤坏死因子α、血管内皮生长因子(VEGF)、TGF-β和成纤维细胞生长因子等都能加速这一过程[12-14]。外泌体中含有大量遗传物质和蛋白质，使之成为细胞与细胞之间信息交流的关键介质[8-9]。因此，我们假设RPE细胞来源的外泌体可能是内皮细胞功能障碍的原因之一。正如预期的那样，大量的外泌体在高糖条件下由ARPE-19细胞释放，然后由HRMECs内化。说明外泌体通过调节血管生成相关因子的表达进而在内皮细胞增殖、迁移和血管生成中发挥重要的生理和病理作用[15]，这为PDR的治疗提供了一个新的候选靶点。

在各种人类纤维性疾病中，从纤维性组织中分离出来的内皮细胞能够产生肌纤维母细胞，但这些细胞缺失内皮细胞标志物[16-19]。EndoMT最初是在心脏发育过程中发现的，随后的研究逐渐揭示了它在肝脏、角膜、肺脏、真皮和肾脏纤维化的发展和进程中的重要作用[17-18]。TGF-β超家族被认为是EndoMT的重要调节者，通过Smad依赖和非依赖途径，直接调节EndoMT诱导转录因子。内皮功能障碍是糖尿病慢性并发症的主要病变基础，先前的研究已经证实，EndoMT与PDR相关的纤维化进展有关[19]。本研究我们发现，在高糖条件下，HRMECs中TGF-β/Smad信号转导通路被激活，且这种激活状态可被ARPE-19细胞分泌的外泌体显著逆转。此外我们还发现，高糖可诱导外泌体中miR-4488高表达，而这又与TGF-β/Smad信号通路的失活有关。说明ARPE-19细胞分泌的外泌体也介导了miR-4488的细胞间传递，进而抑制高糖诱导的HRMECs的间充质表型标志物Desmin和α-SMA蛋白表达上调。这些数据均证实，高糖环境中ARPE-19细胞分泌的外泌体逆转高糖诱导EndoMT进程的作用机制之一可能与上调miR-4488表达有关。因此，促进RPE细胞释放包含大量miR-4488的外泌体和抑制HRMECs EndoMT进程可能是阻止或延缓PDR患者视网膜纤维化的必要条件。

综上，HRMECs EndoMT进程和RPE细胞之间存在着重要的相互影响，提示在高糖条件下，ARPE-19细胞释放的外泌体可通过miR-4488/TGFβR2/Smad介导的机制抑制HRMECs EndoMT进程。我们认为，RPE细胞可能在高糖调节HRMECs表型中发挥着关键作用。