双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变大鼠血液流变学和视网膜微血管的影响△

赵永旺 符超君 颜家朝 聂辅娇 陈佳玉 郑新宝 杨雪艳 秦裕辉

糖尿病视网膜病变(DR)是由于长期慢性高血糖引起的视网膜微血管进行性损害，可导致视网膜渗出、出血、新生血管形成、玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离等严重致盲性眼病。它也是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一[1-3]。DR不仅严重威胁糖尿病患者的生存质量，也会给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。大量的实验和临床研究[4-6]显示，双丹明目胶囊对DR大鼠具有降糖减脂，改善血液流变学和视网膜功能的作用，可明显改善患者视网膜微血管瘤数、出血、渗出、视野缺损面积、中心视野光敏感度。血液流变学与微血管关系密切，主要影响微血管生理病理变化，双丹明目胶囊可以改善DR大鼠血液流变学状态，那么对视网膜微血管作用又是怎样呢？本研究探讨双丹明目胶囊对DR大鼠血液流变学和视网膜微血管的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组取健康、远交系、1个月龄SPF级雄性SD大鼠72只，体重(230±20)g。大鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，饲养于湖南省中医药研究院SPF级实验动物中心。实验动物处理符合动物伦理道德规范，实验室条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定。将大鼠随机分为6组：正常组、模型组、对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组12只。

1.2 实验药品与试剂双丹明目胶囊(北京岐黄制药有限公司)，羟苯磺酸钙胶囊(西安利君制药有限责任公司)，100 g·L-1水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司)，复方托吡卡胺滴眼液(参天制药中国有限公司)，链脲佐菌素(美国 Sigma公司)，血糖测量仪、血糖试纸(美国Johnson公司)，5417R 低温高速离心机(德国 Eppendorf 公司)， FASCO-3010 D 全自动血液流变快测仪(瑞士 Roche 公司)，MK3 型酶标仪(美国 Thermo 公司)，眼底造影仪(德国海德堡公司)。

1.3 动物模型建立将SD大鼠适应性喂养5 d后，正常组大鼠用普通饲料喂养，其余大鼠采用高脂乳剂(含胆固醇、丙硫氧嘧啶、猪油、胆酸钠、聚山梨酯80、丙二醇)连续灌胃2周后，禁食12 h，自由饮水。将10 g·L-1链脲佐菌素溶于0.1 mol·L-1柠檬酸缓冲液(pH=4.5)中，取出需要造模的大鼠，按60 mg·kg-1剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素，72 h后禁食，轻度乙醚麻醉，空腹尾静脉采血，检测血糖，目测八联试纸检测尿糖。连续3次空腹血糖≥16.70 mmol·L-1、尿糖+++或以上为糖尿病大鼠建模成功，空腹血糖≤14.00 mmol·L-1，视为建模不成功，予以剔除。正常组大鼠给予等体积柠檬酸缓冲液一次性腹腔注射。每周观察大鼠一次，连续12周，散瞳后采用荧光素眼底血管造影检查，如果发现大鼠眼底出现微血管荧光素渗漏等改变，视为DR造模成功。

1.4 实验给药正常组和模型组大鼠给予生理盐水，对照组大鼠给予羟苯磺酸钙(等效给药浓度为5.8 mg·kg-1)，高、中、低剂量组大鼠分别给予不同剂量的双丹明目胶囊(22.4 g·kg-1、11.2 g·kg-1、5.6 g·kg-1)，分别是临床等效剂量的2.0倍、1.0倍、0.5倍，各组均按10 mL·kg-1剂量灌胃。

1.5 检测指标血液流变学指标包括全血黏度(WBV)、血浆黏度(PV)、红细胞沉降率(ESR)、红细胞压积(HCT)、纤维蛋白原含量(FIB)。视网膜动脉、静脉血管管径及视网膜微血管荧光素渗漏面积：对各个时期SD大鼠眼底图片通过海德堡共聚焦激光造影仪自带软件进行分析，对眼底视网膜动脉、静脉血管管径和视网膜微血管荧光素渗漏面积进行量化。统计造模及后续观察过程中发现的造模不成功以及出现代谢性白内障或新生血管性青光眼的大鼠数。

1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差表示，满足正态性及方差齐性的数据多组间比较采用F检验，两两间比较采用q检验，否则采用Kruskal-WallisH检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠血液流变学指标检测结果连续灌胃12周后，与正常组相比，模型组、中剂量组、低剂量组大鼠WBV、PV、ESR、HCT、FIB均升高(均为P<0.05)；与模型组相比，对照组和高剂量组大鼠WBV、PV、ESR、HCT、FIB均降低(均为P<0.05)，中剂量组HCT也降低(P<0.01)；与对照组相比，中剂量组大鼠WBV、PV、ESR、HCT、FIB均升高,低剂量组大鼠除HCT外，各项指标亦均升高(均为P<0.01),高剂量组大鼠HCT则降低(P<0.01)；与高剂量组相比，低剂量组大鼠WBV、PV、ESR、HCT、FIB均升高，中剂量组大鼠除HCT外，各项指标亦均升高(均为P<0.01)(表1)。

表1 各组大鼠血液流变学指标检测结果比较

2.2 造模成功后各组大鼠视网膜动脉和静脉血管管径通过海德堡共聚焦激光造影仪自带软件进行分析处理，量化大鼠视网膜动脉和静脉血管管径。造模成功后，与正常组比较，其他各组大鼠视网膜动脉血管管径均变细，静脉血管管径均增粗(均为P<0.05)(表2)。这表明DR大鼠视网膜微血管已经发生改变，血液流变学状态受到影响。

表2 造模成功后各组大鼠视网膜动脉和静脉血管管径比较

干预12周后，高剂量组大鼠视网膜动脉血管管径接近正常组，静脉血管管径仍然变粗(均为P<0.05)；其他各组大鼠视网膜动脉血管管径普遍变细，静脉血管管径迂曲扩张(均为P<0.05)(表3)。这表明高剂量双丹明目胶囊可扩张大鼠视网膜动脉，对视网膜静脉血管作用不明显。

表3 各组大鼠干预12周后视网膜动脉和静脉血管管径比较

2.3 各组大鼠视网膜微血管荧光素渗漏面积比较与模型组相比，对照组和高剂量组大鼠视网膜微血管荧光素渗漏面积减小(均为P<0.01)；与对照组和高剂量组相比，中剂量组、低剂量组大鼠视网膜微血管荧光素渗漏面积均增大(均为P<0.01)(表4)。这表明高剂量双丹明目胶囊可以减少DR大鼠视网膜微血管荧光素渗漏面积，改善视网膜结构。

表4 各组大鼠视网膜微血管荧光素渗漏面积比较

2.4 大鼠造模不成功、白内障、青光眼发生情况造模过程中，有3只大鼠造模不成功。后续观察过程中，模型组有4只大鼠发生白内障，3只发生青光眼；对照组和高剂量组各有1只大鼠发生青光眼；中剂量组和低剂量组各有2只发生白内障，各有1只发生青光眼。

3 讨论

DR是工作年龄人群失明的主要原因[7]。DR患者微血管中红细胞聚集性增强、压积增大、血液流变学发生异常，这些改变会导致视网膜微血栓形成，阻塞微血管，形成微血管瘤，加重视网膜缺血缺氧，加速DR疾病恶化[8]。研究表明，糖尿病患者存在明显的血液流变学异常，纠正异常的血液流变学状态可显著降低DR的发生率[9-10]。视网膜血管是全身血管系统中唯一可以无创直接观测到的血管，血管宽度、角度、分支形态等均可作为全身血管性疾病的诊断依据[11]。视网膜动脉和静脉血管管径的变化可以反映眼底视网膜血供情况，微血管瘤的多少反映了DR的进展情况。

血液流变学指标中的WBV、PV是反映体内血液流动性的主要指标，ESR、HCT增高可导致切变率下降，血液黏度增高。DR的发生与血液流变学关系密切，调节血液流变学状态是DR的主要治疗手段。双丹明目胶囊由女贞子、旱莲草、山茱萸、山药、丹参、三七、丹皮、泽泻、茯苓、红土茯苓、牛膝等11味中药组成。方中女贞子、旱莲草可滋补肝肾为君药，山茱萸、山药可补肾养肝、健脾固精，丹参、三七可养血活血、化瘀通络共为臣药，丹皮、泽泻、茯苓、红土茯苓可清肝泻火、除湿利水为佐药，牛膝能活血逐瘀且性善下行，可防气血上逆为使药。诸药合用共奏益肾养肝、活血明目之功，主治肝肾阴虚、瘀血阻络所致的DR。方中三七的主要成分三七皂苷具有扩张血管平滑肌，调节血脂，抑制血小板聚集，防止血栓形成等功效，可以改善局部血供和血流高凝状态[12-13]。本研究发现，双丹明目胶囊具有降低WBV、PV、ESR、HCT、FIB，理论上可以改善DR大鼠血液流变学状态。我们推测该方可通过方中三七皂苷等成分，或通过中药复方全身调理发挥作用。以往研究显示，羟苯磺酸钙可以降低血液黏度和血小板活性，预防和减少毛细血管梗死，改善血液流变学状态[11，14]，与本次研究结果相一致。

临床上人们可以通过DR视网膜动脉和静脉血管管径的变化预估视网膜血供，评判DR进展及治疗效果。已有研究显示，丹参和三七具有减少血栓形成和血小板聚集，增加血管通透性，缩短凝血时间，改善血管微循环的功能，同时三七中的三七皂苷和黄酮苷具有选择性扩张血管平滑肌，加速血液流动和细胞氧代谢，提高组织对缺血与缺氧的耐受能力[15-16]。本研究发现，双丹明目胶囊可以扩张大鼠视网膜动脉，对视网膜静脉作用不明显，推测可能与其含有三七和丹参有关，其对视网膜组织的保护作用可能与改善视网膜缺血、缺氧状态有关。

微血管荧光素渗漏的出现提示视网膜组织已经发生病理性改变，周细胞可能受到损害。周细胞可以支持血管内皮细胞，调节视网膜毛细血管血流量和细胞增殖活性[17-18]。周细胞结构和功能的完整性对维持视网膜组织结构稳定性十分重要。本研究发现，DR大鼠视网膜血管出现微血管荧光素渗漏现象，而高剂量双丹明目胶囊可以逆转DR大鼠视网膜结构的变化，大鼠微血管荧光素渗漏面积明显减小，显示了双丹明目胶囊对DR大鼠视网膜的保护作用。我们前期研究发现，双丹明目胶囊中的有效成分齐墩果酸及其衍生物、酚酸等具有保护血管、抗血栓、抗炎、抗氧化等活性[19]。我们推测其可能通过抑制视网膜中组胺、5-羟色胺等血管活性物质合成，降低毛细血管通透性，保护周细胞，发挥对视网膜的保护作用[20]。

研究显示，羟苯磺酸钙胶囊可以减少晶状体上皮细胞凋亡，延缓晶状体混浊的发生与发展，降低白内障发生率[21-22]。本研究中双丹明目胶囊高剂量组大鼠白内障发生率低。除了正常组未出现青光眼以外，各模型组青光眼的发生规律不明显，双丹明目胶囊是否可以降低DR大鼠青光眼风险尚无明确结论。

综上所述，双丹明目胶囊可以改善DR大鼠血液流变学状态，扩张视网膜动脉，改善视网膜血供，减少视网膜微血管荧光素渗漏面积。