IGF-1、bFGF、ITS、2-ME2对牛耳皮肤成纤维细胞细胞周期的影响

孟晓俣，刘 欣，孙 羽，张广辉，张 涌

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)

影响体细胞核移植效率的因素有很多，其中供体细胞核不完全重编程是影响体细胞核移植效率最重要的因素。处于不同细胞周期中的供体细胞，染色质结构和表观遗传修饰不同，体细胞核移植效率也不同。通常认为，G1或G0期是最适合作为体细胞核移植供体细胞的细胞周期。目前体细胞核移植程序中供体细胞一般通过血清饥饿或接触抑制处理，让更多的供体细胞处于G1或G0期，但是这两种处理方法获得的G1或G0期的细胞只占细胞总数的70%～80%，并且获得的供体细胞容易受到损伤，因此优化供体细胞的处理方法对于完善体细胞核移植技术具有重要意义。

细胞周期分为G1、S、G2、M期。G1期还可分为G1早期和G1晚期。细胞质桥连接的两个细胞即为eG1期细胞，有研究通过震荡法获取eG1期细胞[1]。G0(静止期)细胞既不生长也不增殖。这种状态通常由有丝分裂过程中所需物质耗竭(如血清饥饿)引起，具有特定的转录[2-3]和代谢[4]变化等特征。有研究发现，对于非转基因的成纤维细胞，血清饥饿法诱导获得的G0期细胞核移植后，足月犊牛的存活率显著高于G1早期和G1晚期细胞。但是对于转基因的成纤维细胞，G1期细胞核移植后重构胚发育至足月犊牛的比例相较于G0期细胞显著升高，犊牛存活率及发育至断奶的比例也更高。用非转基因的eG1期细胞核移植后获得的重构胚发育明显优于G0和G1晚期。与G1晚期作为供体细胞时获得的重构胚相比，eG1期细胞作为供体细胞时，1级和2级囊胚发育率更高[5]。这些研究表明，eG1期细胞是体细胞核移植最适合的细胞周期。

本试验研究不同生长因子(2-ME2、IGF-1、bFGF、ITS)及其组合(2-ME2+IGF-1+bFGF+ITS)对细胞周期中G0/G1期细胞比例的影响，并与震荡法联合使用观察获得的细胞中eG1细胞比例，以期在短期内获得更多数量及更高比例的eG1期细胞，为体细胞核移植提供适合的供体细胞处理方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛耳皮肤成纤维细胞(渭南华阴市草滩第一牧场，采取母牛新鲜牛耳皮肤组织分离培养)；300目细胞筛；0.22 μm滤器购自美国Millipore；小鼠抗波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(ab8069)购自美国Abcam；山羊抗小鼠抗体(A-21424)购自美国Thermo； DMEM/F12+GlutaMAX TM-1(1X)、Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine(ITS-X)(100X)、IGF-1、bFGF、胎牛血清均购自美国Gibco；2-ME2购自美国Sigma；二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、胰蛋白酶(Trypsin)购自美国Amresco；DAPI、体积分数4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液Triton X-100、免疫染色封闭液、免疫荧光染色一抗稀释液、免疫荧光染色二抗稀释液均购自中国上海碧云天；生理盐水购自中国陕西圣奥动物药业。

1.2 试验方法

1.2.1 牛耳皮肤成纤维原代细胞分离与培养 采用组织块贴壁培养法分离牛耳皮肤成纤维细胞。采集牛耳皮肤组织，用含青霉素及硫酸链霉素的PBS反复冲洗，加入少许细胞培养液，用眼科剪剪碎皮肤组织。将组织块间隔排布，均匀贴附在60 mm细胞培养皿中，倒置于饱和湿度、体积分数5% CO2、38.5 ℃恒温培养箱中。待组织块周围液体即将蒸发完前加3 mL培养液，正置入培养箱，2～3 d后观察细胞迁出情况并更换新鲜培养液，培养至细胞长满后弃掉组织块，将细胞传代或冻存。试验所用细胞均为F7-F11细胞。

1.2.2 牛耳皮肤成纤维细胞传代培养 将已长满培养皿皿底的牛耳皮肤成纤维原代细胞进行传代培养。弃培养液，加入胰酶细胞消化液并置于培养箱消化3～4 min，用移液器吹打贴壁细胞，待所有细胞悬浮，加入细胞培养液终止消化。加入离心管，1 050 r/min离心5 min(以下离心条件均相同)，弃上清，培养液重悬细胞加入培养皿，“十字法”混匀后置于培养箱。

1.2.3 震荡法获取牛耳皮肤成纤维G1期细胞 复苏细胞至24孔板，用含体积分数10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12的细胞培养液培养，待细胞汇合度达90%后传代，传代后汇合度达到80～90%时将细胞传代至35 mm细胞培养皿。24 h后，镜下观察细胞状态及汇合度。弃原培养液，加DPBS洗1～2次，分别对细胞进行不同的处理：对照组为添加培养液继续培养细胞，处理组为向培养液中分别添加1 μmol/L 2-ME2(2-ME2)、20 ng/mL IGF-1(IGF-1)、10 ng/mL bFGF(bFGF)、ITS(ITS)及4种细胞因子组合(2-ME2+ IGF-1+ bFGF+ ITS)，培养细胞2 h，将培养皿置于涡旋振荡器上于7档震荡2 min。收集培养液，离心后弃上清，用培养液重悬混匀，血球细胞计数板计数。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 当60 mm细胞培养皿中细胞汇合度达60%时，消化后离心并收集细胞，PBS洗3次。体积分数4%多聚甲醛 4 ℃过夜固定细胞，离心后弃上清，PBS洗3次。500 μL Triton-X 100透化液室温孵育30 min，PBS洗1次。生理盐水避光稀释DAPI至3 μg/mL后加至管内重悬细胞，PBS洗1次，加500 μL PBS重悬，用300目细胞筛过筛至流式管内，上机。

1.2.5 牛耳皮肤成纤维细胞的免疫荧光鉴定 牛耳皮肤成纤维细胞汇合度达到80%左右时，弃原培养液，PBS洗2次，加入体积分数4%多聚甲醛溶液4 ℃过夜固定，PBS洗3次；加Triton-X 100透化液，室温孵育30 min，PBS洗3次，用免疫荧光封闭液室温封闭2 h，吸弃上清，小鼠抗Vimentin单克隆一抗(1∶1 000)4 ℃过夜孵育；PBS洗3次，山羊抗小鼠二抗(1∶500)室温孵育2 h，PBS洗3次后参照“1.2.4”进行DAPI染色，将细胞置于荧光倒置显微镜DAPI激发光下拍照。

1.3 数据处理

所有数据用SPSS 20.0进行统计分析，结果用“平均数±标准差”表示。流式细胞仪结果分析使用FLOW JO 10.7.1软件，柱状图使用EXCEL 2019软件制作。

2 结果与分析

2.1 牛耳皮肤成纤维原代细胞的分离培养

牛耳皮肤组织块贴壁培养11 d后，镜下观察牛耳皮肤成纤维原代细胞呈长梭形(图1)。

图1 牛耳皮肤成纤维细胞显微图Fig.1 Microscopic image of bovine ear skin fibroblasts

2.2 牛耳皮肤成纤维细胞免疫荧光鉴定

选取F7代牛耳皮肤成纤维细胞铺于24孔板进行免疫荧光染色，细胞纯度可达100%(图2)。在荧光倒置显微镜下可观察到明场下牛耳皮肤成纤维细胞为长梭形，牛耳皮肤成纤维细胞胞质中的波形蛋白为成纤维细胞的主要标志物，染色后呈红色荧光，DAPI着色的细胞核呈蓝色荧光。

Bright field表示牛耳皮肤成纤维细胞的明场图； DAPI表示DAPI着色的细胞核呈现的蓝色荧光； Vimentin表示对牛耳皮肤成纤维细胞染色后的胞质中的波形蛋白呈现的红色荧光；Merge是合并图Brightfield represents bovine ear skin fibroblasts under brightfield; DAPI represents the blue fluorescence of the nucleus colored by DAPI; Vimentin represents the red fluorescence of vimentin in the cytoplasm of bovine ear skin fibroblasts; Merge is the merged image图2 牛耳皮肤成纤维细胞免疫荧光鉴定Fig.2 Immuno fluorescence identification of bovine ear skin fibroblasts

2.3 不同细胞因子对G0/G1期细胞的影响

流式细胞仪检测细胞周期发现(图3)，相同处理时间内， 2-ME2处理组G0/G1期细胞比例相较其他组显著增加(P<0.05)，其他组间无显著差异。

*表示差异显著(P<0.05)；Control为对照组，下同* means significant difference (P<0.05); Control is the control group,the same below图3 G0/G1期细胞所占比例 Fig.3 Proportion of cells in G0/G1 phase

2.4 不同细胞因子联合震荡法对G1期细胞的影响

用血球细胞计数板分别对震荡所得细胞进行计数结果显示(图4)，在相同处理时间内，2-ME2处理组 eG1期细胞较其他组显著增加(P< 0.05)，其他组间无显著差异。

图4 eG1期细胞所占比例Fig.4 Proportion of cells in eG1 phase

3 讨论与结论

目前，处于细胞周期中哪个阶段的供体细胞最适合进行体细胞核移植尚无定论。有研究表明，对于转基因供体细胞，源自eG1期细胞的重构胚发育明显优于G0期和G1晚期；对于非转基因供体细胞，源自G1期的重构胚的发育率明显低于G0期，但胚胎移植后源自G1期的重构胚得到的克隆牛在断奶后存活率更高[5]。处于G1期的细胞主要合成RNA和核糖体，为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备，有研究发现eG1期细胞核移植后所得克隆牛的存活率提高[5]。G0期细胞处于细胞的静止期，移入卵母细胞后能够与其DNA复制同步，减少了核移植胚胎发育过程中染色体畸变的可能性。那么如何提供更多处于G0/G1期及eG1期的细胞，对于提高SCNT效率有重要意义。

影响细胞周期调控的因素包括细胞周期蛋白依赖激酶的磷酸化、细胞周期蛋白的产生与降解、细胞因子等。有研究发现1 μmol/L 2-ME2与震荡法联合作用下可以使更多的牛胎儿成纤维细胞处于有丝分裂期[6]；20 ng/mL IGF-1可以增强小鼠精源干细胞的增殖能力[7]；对从大鼠脂肪间充质干细胞中分化出成纤维细胞[8]和大鼠巩膜成纤维[9]来说，bFGF促进细胞增殖的最佳浓度为10 ng/mL； Keenan等[10]总结了胰岛素、转铁蛋白和硒对细胞增殖的影响，10 μg/mL胰岛素+5.5 μg/mL转铁蛋白+6.7 ng/mL亚硒酸盐(ITS)的组合已经成为商业上可获得的培养基补充剂。因此本研究选择上述细胞因子开展试验。

2-ME2是体内雌二醇的一种代谢产物。有研究发现，2-ME2处理人慢性髓原白血病细胞后G0/G1期细胞比例增加，S期比例下降[11]。此外，随着2-ME2浓度的升高，骨肉瘤MG63细胞的细胞周期停留在G0/G1期比例显著性提高，而S期和G2/M期的细胞比例则显著性下降[12]。但也有研究发现，平滑肌细胞经0～10 μmol/L 2-ME2作用24 h后，会抑制G2/M至G0/G1的转变[13]。本研究发现，在2-ME2处理后，与对照组和其他处理组相比，G0/G1期及eG1期比例均显著升高(P<0.05)，说明2-ME2处理2 h后，更多的牛耳皮肤成纤维细胞处于G0/G1期，笔者推测2-ME2对细胞周期的作用不仅受2-ME2浓度和处理时间的影响，也受细胞种类的影响。此外，还有研究表明BIX-01294 作为一种有效的G9a甲基转移酶抑制剂，1 μmol/L的BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞可增加G1/G0期细胞比例，后续可进一步研究[14]。

bFGF是由146个氨基酸组成的多肽，能通过旁分泌或自分泌机制发挥许多重要的生理特性，具有较强的促进细胞增殖分化的作用，与相应受体结合后可通过酪氨酸蛋白激酶系统传递信息并逐级放大，最终产生细胞增殖效应。有研究发现，从细胞增殖和成纤维细胞胶原蛋白的表达来看，bFGF最佳质量浓度为10 ng/mL，在该浓度下，成纤维细胞生长更快，并向细胞外基质中分泌更多的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白，这可能有助于微环境的稳定[8]。此外，bFGF与细胞膜上相应的受体结合后，定位细胞核，通过RNA聚合酶I加强基因转录从而加速细胞G0～G1，G1～S期的转换，促进细胞的分裂与增殖[15]。还有研究发现1、50、100、500 ng/mL的bFGF处理细胞后G1期细胞减少，S期细胞增加，进入有丝分裂的细胞数增加[16]。本研究使用10 ng/mL的bFGF处理后，G0/G1期及eG1期细胞比例无显著变化。虽然bFGF具有促进细胞增殖的作用，但对牛耳皮肤成纤维细胞来说，bFGF处理细胞2 h可能无法推动细胞周期向G0/G1期转变，增加G0/G1期及eG1期细胞的数量。

IGF-I是一种广谱促分裂素，通过结合胰岛素样生长因子受体来增强鸟氨酸脱羧酶的活性，促进细胞内DNA、RNA和蛋白质的生物合成，抑制细胞凋亡，发挥很强的促有丝分裂原作用，促使细胞从G0期向G1期转变，进而刺激cyclin D1和CDK4基因表达，促使视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白磷酸化合成cyclin E，释放转录因子E2F，促进细胞从G1期向S期转变，缩短S期时间，导致G0/G1期细胞比例显著降低，细胞分裂的速度加快，周期缩短，促进细胞增殖[17-18]。本研究结果表明，20 ng/mL的IGF-I处理后，G0/G1期及eG1期细胞比例无显著变化。

胰岛素-转铁蛋白-硒是一种含有胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠的培养基添加剂，在低血清培养基中添加可促进细胞的生长与增殖。有研究发现，将ITS-X添加至DMEM/F12、F12、DMEM、EMEM等培养液，且FBS体积分数<4%时，能够促进各种类型细胞的生长[19]。但也有研究表明，将体积分数为1%的ITS加入体积分数为10%的FBS的培养液中能增强人耳软骨细胞的增殖以及减少去分化，但是单独使用却不能促进软骨细胞的增殖[20]。其中，胰岛素通过葡萄糖转运蛋白对哺乳动物细胞具有多效合成代谢作用，能够促进葡萄糖和氨基酸摄取[21-22]、脂肪生成[23]、单价阳离子[24]和磷酸盐转运[25]、蛋白质[26-27]和核酸合成[28]，同时抑制糖原、蛋白质和脂肪的分解。转铁蛋白(Transferrin，Trf)是一种高度保守的血清糖蛋白，具有运输铁的作用。Trf作为无血清培养基必需添加的组分，可以通过与转铁蛋白受体相互作用，在无血清细胞培养过程中发挥重要功能。Trf能与三价铁离子可逆性结合，调节铁离子转运及代谢，维持细胞内的铁平衡及细胞生长与增殖。同时，铁也是一种重要的胞外抗氧化剂，有助于降低氧自由基和过氧化氢对细胞的毒性。硒以亚硒酸盐的形式存在，具有抗氧化作用。本研究结果表明，在ITS处理2 h后，G0/G1期及eG1期细胞比例无显著变化，推测只有在低血清培养液中添加ITS才会促进细胞的生长和增殖，本研究中使用含10%FBS的培养液，其中血清含量过高可能影响ITS发挥作用。但血清是培养供体细胞最有效的生物液体之一[29]。其中的生长因子、激素等物质对成纤维细胞的生长具有重要作用，降低血清含量可能会影响细胞增殖。因此，ITS对细胞周期的影响仍需进一步探索。

2-ME2+IGF-1+bFGF+ITS处理组与对照组相比，细胞周期无显著变化，推测4种因子对细胞的促增殖作用与对细胞周期的阻滞作用相互影响。但目前4种因子共同作用的机理仍不清楚，需要进一步研究。

本试验通过研究细胞因子对细胞周期的调控，可在体细胞核移植过程中短时间内获得更多G0/G1期和eG1期的供体细胞，为提高体细胞核移植效率提供了新线索。