IL-8/miR-182正反馈调控轴在非小细胞肺癌中的作用机制研究

赵明娜，张宸梓，洪秋双，娄加陶

（1.上海交通大学医学院附属第一人民医院检验医学中心，上海 200080；2.中南大学湘雅医院血液科，湖南 长沙 410008；3.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院检验实验医学中心，上海 200437）

肺癌是我国发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一，也是国际上癌症相关死亡的首要原因，患者5年生存率较低[1]。因此，探索肺癌发生、发展的分子机制，对提高肺癌的早期诊断率，精确分型分期，以及预测复发和预后具有重要意义[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类大小约为22 nt的非编码小分子RNA，通常与靶基因mRNA 3'非翻译区（untranslated region，UTR）结合，通过降解mRNA或抑制其翻译，在转录后水平负调控靶基因表达[3]。许多癌基因、抑癌基因和一系列与细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移、血管生成相关的基因都受到miRNA的调控[4]。另外，炎症因子在肿瘤的发生、发展中也发挥着重要作用。炎症因子刺激可以调节特定的致癌miRNA或抑癌miRNA的表达，影响miRNA靶基因的翻译，导致靶基因表达发生变化，而这些靶基因表达的变化可以促进或抑制肿瘤的发生、发展[5]。白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是一种促炎性CXC趋化因子，主要受NF-κB信号通路调控。有研究结果显示，IL-8的过度表达与多种肿瘤有关，其参与了血管生成和内皮细胞迁移，进而导致肿瘤进展[6]。miR-182-5p是miR-183/96/182簇中的一员，是一种新型的肿瘤相关miRNA，参与了多种肿瘤的发生、发展，与非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）的发生密切相关[7]。但IL-8和miR-182在NSCLC中是否相互作用，并影响NSCLC的发展，仍有待进一步研究。为此，本研究拟探讨IL-8和miR-182在NSCLC发展中可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2011年7月—2016年6月上海市胸科医院确诊为NSCLC的40例患者（NSCLC组），其中男28例、女12例，年龄43～71岁。所有患者均为初诊，术前均未接受治疗。收集所有患者术前血清样本和术中切除的癌组织及癌旁组织（距癌灶组织＞5 cm、外观正常）样本。另选取上海市胸科医院体检健康者40名（正常对照组），其中男21名、女19名，年龄40～56岁，收集其血清样本。本研究经上海市胸科医院伦理委员会批准，所有对象均签署知情同意书。

1.2 细胞来源和培养

人NSCLC细胞株A549购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 细胞转染与刺激

1.3.1 细胞转染 根据转染质粒进行分组，包括STAT3-siRNA质粒（STAT3-siRNA组）、阴性对照siRNA质粒（NC-siRNA组）、miR-182模拟物质粒（miR-182 mimic组，过表达miR-182）、miR-182抑制剂质粒（miR-182 inhibitor组，抑制miR-182表达）、阴性对照质粒（mimic NC组、inhibitor NC组），所有质粒均购自广州锐博生物科技有限公司。待细胞融合度为70%～80%时，参照Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）试剂说明书分别将miR-182 mimic、mimic NC、miR-182 inhibitor、inhibitor NC、STAT3-siRNA或NC-siRNA分别转染至A549细胞，然后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，分别于24、48 h后提取RNA和蛋白，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测miR-182的相对表达量，采用免疫印迹法检测STAT3蛋白的表达量，确定转染效率。

1.3.2 IL-8刺激 将A549细胞铺板融合至50%左右或转染miR-182 inhibitor 6 h后，换成无血清的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，加入10 ng/mL IL-8（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司）或磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）（对照组），于培养箱中培养24 h后收集细胞，提取RNA和蛋白，用于后续实验。

1.3.3 IL-8受体抑制剂Repertaxin和NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082刺激 Repertaxin和BAY11-7082均购自美国MedChemExpress公司。A549细胞转染或用IL-8刺激后，在收取细胞前12 h，加入20 μmol/L Repertaxin或50 μmol/L BAY11-7082，12 h后收集细胞，提取RNA和蛋白，用于后续实验。

1.4 RT-qPCR检测miR-182和IL-8的相对表达量

采用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取细胞总RNA，测定RNA浓度。使用RNA逆转录试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]逆转录成互补DNA（complementary DNA，cDNA）。以1 μL cDNA为模板，进行RT-qPCR，试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。miR-182逆转录引物为5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGTGTGAG-3'，前向引物为5'-ACACTCCAGCTGGGTTTGGCAATGGTAGAACT-3'。通用反向引物为5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3'。U6上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。IL-8上游引物为5'-CTGGCCGTGGCTCTCTTG-3'，下游引物为5'-CCTTGGCAAAACTGCACCTT-3'。β-actin上游引物为5'-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3'，下游引物为5'-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3'。反应条件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。所有反应均设置3个复孔，采用2-△△Ct法进行相对定量。检测仪器为ABI 7900实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.5 免疫印迹法检测蛋白相对表达量

收集A549细胞和转染miR-182 mimic、miR-182 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC、STAT3-siRNA或NC-siRNA的A549细胞，使用裂解液提取细胞总蛋白，加入2×loading蛋白上样缓冲液，95 ℃ 加热5 min，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，采用湿转法转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，2%牛血清白蛋白封闭2 h，加入一抗[信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）蛋白兔单克隆抗体、Phospho-NF-κB p65蛋白兔单克隆抗体（简称P-p65抗体）、NF-κB p65蛋白兔单克隆抗体（简称p65抗体），美国CST公司]和内参抗体β-连环蛋白1（beta-catenin 1，CTNNB1）兔单克隆抗体（美国CST公司）4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（美国Sigma公司）室温孵育1 h，采用化学发光法检测蛋白表达。

1.6 细胞增殖实验

采用溴化噻唑蓝四氮唑（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）法检测细胞增殖能力。分别将转染miR-182mimic、miR-182 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC质粒的A549细胞和PBS刺激（对照组）、10 ng/mL IL-8刺激（IL-8组）、转染miR-182 inhibitor质粒并加入10 ng/mL IL-8刺激（IL-8+miR-182 inhibitor组）的A549细胞，按5 000个/孔铺在12孔板中，贴壁后，在培养液中加入5 mg/mL MTT[生工生物工程（上海）股份有限公司]，培养2 h，移去培养液，加入200 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37 ℃ 孵育30 min，检测570 nm处的吸光度（A）值，以第1天为0点，每隔24 h检测1次，共计4 d。绘制生长曲线。

1.7 细胞迁移试验

分别收集转染miR-182mimic、miR-182 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC质粒的A549细胞和PBS刺激（对照组）、10 ng/mL IL-8刺激（IL-8组）、转染miR-182 inhibitor质料并加入10 ng/mL IL-8刺激（IL-8+miR-182 inhibitor组）的A549细胞，用不含血清的RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，接种于Transwell 小室的上室（2×104个/小室），在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液。常规培养24 h后，用棉签轻轻擦去小室内未迁移的细胞，迁移到小室下表面的细胞用4%多聚甲醛4 ℃固定5 min，PBS洗涤后，用0.1%结晶紫溶液室温染色5 min，PBS充分洗涤后，采用BX53型正置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）观察、拍照并计数。

1.8 免疫荧光试验

收集转染miR-182 mimic、miR-182 inhibitor、mimic NC质粒的A549细胞和转染miR-182 mimic质粒并加入50 μmol/L BAY11-7082处理的A549细胞，采用4%多聚甲醛固定30 min，2%牛血清白蛋白室温封闭2 h，加入一抗（P-p65抗体、p65抗体，1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜，加入二抗[山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488），1∶1 000稀释]，室温避光孵育1 h，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色5 min，采用BX53型正置荧光显微镜观察蛋白的表达和定位，拍照并计数。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。所有实验均独立重复3次。呈正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组与正常对照组血清IL-8水平比较

NSCLC组血清IL-8水平[34.50（24.50～45.75）pg/mL]显著高于正常对照组[11.00（8.00～15.75）pg/mL]（P＜0.01）。

2.2 NSCLC患者癌组织与癌旁组织miR-182相对表达量比较

NSCLC患者癌组织miR-182相对表达量为2.85（1.08～4.83），显著高于癌旁组织[0.40（0.24～0.61）]（P＜0.01）。见图1。

图1 癌组织与癌旁组织miR-182相对表达量比较

2.3 不同血清IL-8水平NSCLC患者之间癌组织miR-182相对表达量比较

将血清IL-8≤35 pg/mL定义为低IL-8，＞35 pg/mL定义为高IL-8。高IL-8组NSCLC患者（24例）癌组织miR-182相对表达量高于低IL-8组NSCLC患者（16例）（P＜0.05）。见图2。

图2 不同血清IL-8水平NSCLC患者癌组织miR-182相对表达量比较

2.4 NSCLC患者血清IL-8水平与癌组织miR-182相对表达量的相关性

NSCLC患者血清IL-8水平与癌组织miR-182相对表达量呈正相关（r =0.810 8，P＜0.000 1）。见图3。

图3 NSCLC患者血清IL-8水平与癌组织miR-182相对表达量的相关性

2.5 A549细胞中miR-182的转染效率

将miR-182 mimic、mimic NC、miR-182 inhibitor、inhibitor NC质粒分别转染至A549细胞中。miR-182 mimic组miR-182相对表达量明显高于mimic NC组（P＜0.01），miR-182 inhibitor组miR-182相对表达量显著低于inhibitor NC组（P＜0.01）。见图4。

图4 各组miR-182相对表达量比较

2.6 miR-182在A549细胞增殖和迁移中的作用

细胞增殖实验结果显示，培养72 h和96 h，miR-182 mimic组的细胞增殖能力均高于mimic NC组（P＜0.01）；miR-182 inhibitor组的细胞增殖能力均低于inhibitor NC组（P＜0.01）。见图5（a）。

细胞迁移实验结果显示，miR-182 mimic组的细胞迁移数目高于mimic NC组（P＜0.01）；miR-182 inhibitor组的细胞迁移数目低于inhibitor NC组（P＜0.01）。见图5（b）、图5（c）。

图5 miR-182在A549细胞增殖和迁移中的作用

2.7 IL-8在A549细胞增殖和迁移中的作用

细胞增殖实验结果显示，IL-8组的细胞增殖能力明显高于对照组（P＜0.01），IL-8+miR-182 inhibitor组的细胞增殖能力明显低于IL-8组（P＜0.01），见图6（a）。

细胞迁移实验结果显示，IL-8组细胞迁移数明显高于mimic NC组（P＜0.01）；而IL-8+miR-182 inhibitor组细胞迁移数低于IL-8组（P＜0.01）。见图6（b）、图6（c）。

图6 IL-8在A549细胞增殖和迁移中的作用

2.8 IL-8对miR-182表达水平的影响

培养24 h后，IL-8组miR-182相对表达量明显高于对照组（P＜0.05），IL-8+Repertaxin组m i R-1 8 2相对表达量明显低于I L-8组（P＜0.01），见图7（a）。STAT3-siRNA组STAT3蛋白表达量明显低于NC-siRNA组（P＜0.01），见图7（b），提示质粒转染成功。STAT3-siRNA组miR-182相对表达量明显低于NC-siRNA组（P＜0.05），见图7（c）。

图7 IL-8对miR-182表达水平的影响

2.9 miR-182对IL-8表达的影响

转染不同质粒48 h后，miR-182 mimic组P-p65蛋白表达量高于mimic NC组（P＜0.05），见图8（a）。miR-182 mimic组p65蛋白入核数量多于mimic NC组，miR-182 inhibitor组p65蛋白入核数量少于inhibitor NC组，见图8（b）、图8（c）。miR-182 mimic组IL-8基因和蛋白的表达量均高于mimic NC组（P＜0.05），miR-182 inhibitor组IL-8基因和蛋白的表达量均低于inhibitor NC组（P＜0.05），见图8（d）、图8（e）。

图8 miR-182和NF-κB信号通路对IL-8表达的影响

3 讨论

目前，恶性肿瘤居全球死亡原因的第1位，而肺癌是肿瘤相关死亡的首要原因[1]。提高肺癌的早期诊断率，并根据肺癌发生、发展的分子机制选择特异性的治疗方法，提高肺癌患者的生存率和生活质量，是当前肺癌相关研究的重点和热点。

趋化因子和细胞因子在肿瘤的发生、发展和转移中起着至关重要的作用。在肿瘤中，趋化因子主要调节血管生成，激活肿瘤特异性免疫反应，并通过自分泌或旁分泌机制直接刺激肿瘤[8]。

IL-8是一种相对分子质量为6 000～8 000的小分子蛋白质，属于CXC趋化因子家族成员[9]，也被称为C-X-C基序配体8。多种肿瘤细胞可通过自分泌IL-8的形式促进肿瘤发展和转移，通过旁分泌的形式影响肿瘤微环境并诱导血管生成。IL-8也会从肿瘤微环境被释放到体循环中，多种肿瘤，如胰腺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、肝癌、食管癌和肺癌患者血清IL-8水平均会升高，并与患者的低生存率显著相关[10-11]。2003年，miR-182首次被发现在感觉器官和组织中大量表达，调节视网膜和内耳的发育，并在成骨细胞和T细胞分化中发挥重要作用[7]。近年来的研究发现，miR-182参与了肿瘤的发生、发展和远处转移，在黑色素瘤中，miR-182会出现异常表达，并靶向叉头转录蛋白O3（forkhead box O3，FOXO3），促进肿瘤转移[12]；在乳腺癌中，miR-182通过靶向转移抑制因子1（MTSS I-BAR domain containing 1，MTSS1），解除Ras同源基因家族成员A（ras homolog family member A，RHOA）的活性抑制，促进应力纤维的形成来促进肿瘤转移[13]。

本研究结果显示，NSCLC患者癌组织miR-182呈高表达，且高IL-8组癌组织miR-182相对表达量高于低IL-8组（P＜0.05）。本研究细胞实验结果显示，IL-8可促进A549细胞的增殖和侵袭；单独过表达miR-182可促进A549细胞的增殖和侵袭，敲低miR-182可抑制A549细胞的增殖和侵袭，且敲低miR-182后，还能恢复IL-8促A549细胞增殖和侵袭的作用；IL-8可通过调节转录因子STAT3来促进miR-182的表达，而miR-182通过上调NF-κB信号通路，促进IL-8的表达和分泌。

综上所述，IL-8/miR-182调控轴在NSCLC细胞的增殖过程中发挥了重要作用，这为探索NSCLC的基因治疗、寻找新的分子治疗靶点提供了实验室依据，为肺癌的治疗提供了一种新的可能。后续研究将通过动物实验进一步阐明并验证NSCLC细胞中IL-8/STAT3/miR-182/NF-κB/IL-8正反馈调控轴的机制，探索靶向抑制该调控轴干预NSCLC的可行性，并在临床患者样本中进行验证，为NSCLC的预防和临床诊治提供新的策略和分子靶点。