选择性ER调节剂对骨肉瘤细胞增殖及CCL2表达的抑制作用研究

孙小丹，许 静，刘鷖雯，何怡青，杜 艳，张国良，高 锋，杨翠霞

（1.上海交通大学附属第六人民医院检验科，上海 200233；2.上海交通大学附属第六人民医院中心实验室，上海 200233）

骨肉瘤是一种罕见的间充质恶性肿瘤，具有较强的侵袭、转移能力，有80%～90%的患者在首次确诊时即伴有潜在转移灶[1]。单纯手术截肢治疗的患者5年生存率低于20%[2]。化疗可显著提高患者的预期寿命，目前临床上多采用手术切除和联合化疗的治疗方案治疗骨肉瘤肺转移患者[3]。然而，大剂量的化疗药物副作用较多，已成为影响治疗效果及预后的关键因素[4]。雌激素受体（estrogen receptor，ER）与肿瘤细胞的生长、耐药及转移能力均密切相关[5]。除性激素依赖的靶器官肿瘤外，ER还表达于胃癌、结肠癌、肺癌及骨肿瘤等恶性肿瘤中[6]。有研究结果显示，调控ER的表达水平或活性可有效改变雌激素/ER依赖的转录因子表达[7]，进而影响肿瘤的药物敏感性、生长特性等。目前，临床上针对ER的选择性ER调节剂有他莫昔芬、雷洛昔芬、巴多昔芬等，其中他莫昔芬可作为化疗增敏剂，增强ER阳性肿瘤患者对化疗药物的敏感性[8]；巴多昔芬可抑制结肠癌细胞中炎症因子的表达，进而抑制结肠癌细胞的增殖，逆转耐药性[9]。目前，针对选择性ER调节剂是否可有效抑制骨肉瘤细胞的增殖及肿瘤进展、调控骨肉瘤细胞炎症因子释放的研究较少。为此，本研究拟探讨骨肉瘤细胞中ER的表达量及选择性ER调节剂他莫昔芬对骨肉瘤细胞增殖和炎症因子表达的影响，同时分析他莫昔芬对骨肉瘤细胞CC趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）2表达的影响，为选择性ER调节剂在骨肉瘤治疗中的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人成骨细胞系hFOB1.19和人骨肉瘤细胞系143B购自美国典型培养物保藏中心，人骨肉瘤细胞系U-2OS购自中国科学院细胞库。hFOB1.19细胞采用含10%胎牛血清、0.3 mg/mL G418、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM），在33.5 ℃、5% CO2环境中培养。143B细胞和U-2OS细胞均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM，在37 ℃、5% CO2环境中培养。细胞密度为70%时进行后续实验。

1.2 细胞增殖实验

采用CCK-8法分别检测加入10 μmol/L二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；上海泽迈生物技术有限公司）（DMSO组）、10 μmol/L 17β-雌二醇（estradiol，E2；美国MedChem Express公司）（E2组）和10 μmol/L他莫昔芬（美国MedChem Express公司）（他莫昔芬组）48 h后的细胞存活情况，CCK-8试剂盒购自美国Promega公司。将143B细胞或U-2OS细胞按3 000个/孔接种到96孔板中，培养24 h后分别加入10 μmol/L他莫昔芬和10 μmol/L E2，培养48 h后，每孔加入20 μL CCK-8试剂，37 °C孵育2 h。采用Epoch酶标仪（美国BioTek公司）检测吸光度（A）值。

1.3 平板克隆形成实验

将143B细胞和U-2OS细胞以800 个/孔接种于6孔板中，加入10 μmol/L DMSO（DMSO组）、10 μmol/L E2（E2组）和10 μmol/L他莫昔芬（他莫昔芬组），培养2周，直到形成肉眼可见的克隆后，采用4%多聚甲醛固定液固定细胞20 min；去除固定液，用1×磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）洗涤3次，再用 0.05%结晶紫溶液染色20 min，使用 1×PBS 洗涤后风干。拍照并记录所形成的细胞克隆数目。

1.4 免疫印迹法

采用RIPA裂解液（上海碧云天公司）裂解细胞，收集细胞裂解物上清液，提取总蛋白。采用蛋白定量试剂盒（美国Sigma公司）测定总蛋白浓度。吸取10 μg蛋白，加入蛋白上样缓冲液（上海碧云天公司），置于100 ℃水浴锅孵育10 min。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，通过湿转法转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，然后用含5%脱脂奶粉的三羟甲基氨基甲烷-吐温缓冲液（tris-hydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）封闭1 h，加入一抗，4 °C下孵育过夜。一抗为磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pPKB；又称pAkt ）308抗体（货号13038T）、pAkt473抗体（货号4060T）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）抗体（货号4695）和磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinase，pERK）抗体（货号4370P），均购自美国Cell Signaling Technology公司。用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的多克隆二抗（杭州联科生物公司）孵育1 h。加入化学发光底物，采用Amersham Imager 600扫描成像系统（美国GE healthcare Bio-Sciences AB公司）分析。以3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，使用Image Pro-Plus 6.0软件（美国 Media Cybernetics 公司）对图像灰度进行分析。

1.5 荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）

将30 000个143B细胞接种到6孔板中，培养24 h后分别加入10 μmol/L他莫昔芬和10 μmol/L E2，培养48 h。采用RNAiso Plus（日本TaKaRa公司）从143B细胞中提取总RNA。采用NanoDrop系统（美国ThermoFisher Scientific公司）测定RNA浓度。采用含gDNA Eraser（日本TaKaRa公司）的PrimeScript T Reagent试剂盒逆转录1 μg mRNA。采用荧光定量PCR检测IL-6、IL-8、TGF-β、CCL2和CCL5基因表达，SYBR试剂盒购自日本TaKaRa公司，检测仪器为QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR仪（美国ThermoFisher Scientific公司）。引物由上海擎科生物有限公司合成，引物序列见表1。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.6 细胞上清的收集及CCL2水平检测

将143B细胞和U-2OS细胞分别接种于24孔板中，加入500 μL培养液，再分别加入10 μmol/L E2（E2组）和10 μmol/L 他莫昔芬（他莫昔芬组），处理3 d，设相应的空白对照（DMSO组）。收集培养上清，离心去除细胞沉淀，保存于-20 ℃冰箱。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测143B细胞和U-2OS细胞培养上清中的CCL2水平。试剂盒购自上海森雄有限公司，最低检测限为63 pg/mL，线性范围125～8 000 pg/mL，批间变异系数＜15%，批内变异系数＜10%，标准曲线r2值为0.999 3。检测仪器为Epoch酶标仪（美国BioTek公司）。严格按仪器和试剂盒说明书操作。

1.7 统计学方法

所有实验至少独立重复3次。采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据多组间比较采用单因素方差分析，2个组之间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤细胞和成骨细胞ER mRNA的表达

2种骨肉瘤细胞（143B和U-2OS）的ER mRNA相对表达量均显著低于成骨细胞（hFOB1.19）。见图1。

图1 骨肉瘤细胞（143B和U-2OS）和成骨细胞（hFOB1.19）ER mRNA表达比较

2.2 选择性ER调节剂他莫昔芬对骨肉瘤细胞生长的抑制作用

143B细胞的CCK-8增殖实验和平板克隆实验结果显示，与DMSO组比较，他莫昔芬组细胞数显著降低（P＜0.05），E2组细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）。U-2OS细胞的CCK-8增殖实验和平板克隆实验结果显示，他莫昔芬组和E2组细胞数均低于DMSO组（P＜0.05）。免疫印迹法结果显示，与DMSO组比较，他莫昔芬组pAkt和pERK水平显著降低（P＜0.05），E2组pAkt和pERK水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 选择性ER调节剂他莫昔芬对骨肉瘤细胞增殖的影响

2.3 选择性ER调节剂对骨肉瘤细胞143B分泌炎症因子的抑制作用

他莫昔芬可显著抑制143B细胞IL-6、IL-8、TGF-β、CXCL1、CCL2和CCL5基因表达，其中对CCL2表达的抑制作用最为显著。见图3。

图3 选择性ER调节剂对骨肉瘤细胞143B炎症因子表达的抑制作用

2.4 选择性ER调节剂他莫昔芬对骨肉瘤细胞（143B和U-2OS）CCL2分泌的抑制作用

他莫昔芬组2种骨肉瘤细胞（143B和U-2OS）CCL2的分泌量显著低于DMSO组（P＜0.05），而E2组CCL2的分泌量显著高于DMSO组（P＜0.05）。见图4。

图4 DMSO、E2和他莫昔芬对骨肉瘤细胞（143B和U-2OS）CCL2分泌的影响

3 讨论

骨肉瘤是高度异质性的间充质肿瘤，临床上多采用手术切除及术后化疗[1]进行治疗，但大剂量使用化疗药物副作用较多[4]，且骨肉瘤患者的5年总体生存率不理想，复发率较高[10]，临床亟需更好的治疗方案。本研究结果显示，选择性ER调节剂他莫昔芬可抑制骨肉瘤细胞的增殖及CCL2表达，提示选择性ER调节剂可作为骨肉瘤切除术后化疗的辅助方案，可能对改善骨肉瘤患者的预后及远期生存率具有积极意义。

骨肉瘤好发于儿童和青少年，此阶段正是性激素分泌最活跃的时期。有研究发现，在骨肉瘤组织及细胞中均发现ER呈低表达[11]；另有研究发现，骨肉瘤的发生可能与ER的水平及活性有关[12]。本研究结果显示，骨肉瘤细胞143B和U-2OS的ER表达量显著低于成骨细胞hFOB1.19（P＜0.05），与文献报道[13]一致。

选择性ER调节剂（他莫昔芬等）目前已被广泛用于ER阳性乳腺癌的内分泌治疗，且疗效良好[14]。选择性ER调节剂可抑制乳腺癌的生长和转移[15]，而在骨组织、心血管系统中，选择性ER调节剂则作为ER激动剂发挥作用[16]。本研究结果显示，E2和他莫昔芬均可抑制骨肉瘤细胞的增殖，且他莫昔芬的抑制作用更强，提示他莫昔芬可作为骨肉瘤化疗的辅助方案。

在肿瘤微环境中，炎症因子可促进肿瘤生长和转移[17]，并诱导肿瘤细胞的侵袭和耐药[5]。有研究发现，手术创伤会导致肿瘤患者体内炎症因子水平升高[18]，升高的炎症因子在肿瘤的休眠和复发中发挥重要作用[19]。CCL2作为趋化因子家族成员之一，是肿瘤微环境中重要的炎症因子，可通过诱导肿瘤细胞侵袭和转移，促进肿瘤的恶性进展[20]。CCL2在多种肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、骨肉瘤中呈异常表达[21]，其表达水平与患者的预后相关。

有研究结果显示，选择性ER调节剂可调控炎症因子的分泌[9]，他莫昔芬可通过直接发挥抗氧化作用来减轻机体氧化应激，从而缓解机体炎症反应[20]。在子宫肌瘤治疗过程中，他莫昔芬联合米非司酮能显著降低子宫肌瘤患者的炎症反应，从而抑制疾病进展[21]。本研究发现，他莫昔芬可显著抑制骨肉瘤细胞中多种炎症因子基因的表达，其中对CCL2基因的抑制作用最强。

综上所述，骨肉瘤细胞ER呈低表达。选择性ER调节剂他莫昔芬可明显抑制骨肉瘤细胞的增殖及CCL2的表达，可能对骨肉瘤患者的预后具有积极作用。