不同基质类型维生素K检测结果分析

贾永娟，刘春冉，李婷，倪君君（北京和合医学诊断技术股份有限公司研究院，北京 100079）

已经发现的天然维生素K有2种：维生素K1和维生素K2。维生素K1主要来源于绿色植物，而维生素K2主要在体内通过肠道细菌合成［1］。维生素K2的主要生理活性以MK4和MK7 2种形式为主，可以在人体内直接发挥生理作用，而维生素K1必须通过生物转化为维生素K2才能够发挥生理作用。维生素K与机体健康密切相关，不仅在机体抗凝系统中扮演重要角色［2］，还参与调节骨代谢［3］、血管钙化和心血管疾病的诊断与治疗［4］、糖代谢、呼吸系统和神经系统的调节、癌症及肿瘤的治疗与预防等［5-7］。人体内维生素K主要活性成分的监测对人体健康有着极为重要的意义，特别是婴幼儿和新生儿维生素K水平受到越来越多的关注和重视［8］。目前维生素K含量测定的样本类型主要是血清［9］和血浆［10］，而指尖血相对于血清和血浆更易获得且对患者创伤更小。本研究比较了指尖血、血清和血浆3种基质维生素K1、MK4和MK7检测结果的差异，为医学检验实验室检测维生素K1、MK4和MK7时选择样本基质提供指导和参考。

1 材料与方法

1.1 标本采集 分别采集30名健康志愿者指尖血100μL，分别采集静脉血并制备新鲜血清、血浆标本各1 mL，排除溶血、脂血、黄疸标本。30名健康志愿者来自本单位，年龄25～45周岁，未服用维生素K制剂，体检结果正常，对本研究知情同意。

1.2 主要仪器与试剂 岛津LC-30ADCL高效液相色谱仪、岛津8050C串联四极杆质谱仪（日本岛津公司），MSA 6.6S-0CE-DM电子天平、A-14C-1EU YCSR-A2B离心机（德国赛多利斯公司）；甲醇、甲酸、无水乙醇（德国默克公司），乙腈、异丙醇、环己烷（美国Fishier公司），Oasis®HLB SPE板（美国Waters公司），维生素K1、MK4、MK7标准品及内标（美国Sigma公司）。天平精密称取维生素K1、MK4、MK7标准品，并用乙腈溶解稀释后得到3种物质混合标准品溶液，浓度范围分别为维生素K1：0.015～250.000 ng/mL，MK4：0.015～15.000 ng/mL，MK7：0.015～30.000 ng/mL；天平精密称取维生素K1、MK4、MK7内标，并用乙腈溶解稀释后得到3种物质混合内标溶液，浓度分别为50 ng/mL、15 ng/mL、15 ng/mL。

1.3 方法 本实验室自建方法。精密移取标准品溶液或人指尖血、血清、血浆各50μL于离心管中，加入10μL内标溶液，充分混匀1 min；加入无水乙醇150μL，涡旋3 min，4℃14 462×g离心10 min，取上清液于Oasis®HLB SPE板，分别用300μL由甲醇和水（含0.5%甲酸）按2∶8比例配制的溶液、300μL乙腈和水（含0.5%甲酸）按9∶1配制的溶液洗涤SPE板，最用500μL由甲醇、异丙醇、环己烷按1∶1∶3比例配制的溶液进行洗脱，室温下氮气吹干洗脱液，最后加入80μL甲醇复溶，涡旋震荡1 min，4℃14 462×g离心3 min，取上清液60μL进样分析；色谱柱：Agilent Eclipse plus C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8μm）；流动相：甲醇（0.1%甲酸）/水（0.1%甲酸），梯度洗脱；质谱条件：APCI源，用自动优化软件对维生素K1、MK4、MK7进行优化得出3种物质最优质谱参数（离子源温度：300℃、DL管温度：300℃、雾化气流速：2.5L/min、接口电压：6kV）。每个基质类型分别检测维生素K1、MK4、MK7含量，每份样本检测2次。

参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）C62-A文件《高效液相色谱质谱检测方法指导原则》，对自建方法进行方法学验证，包括回收率、基质效应、精密度、定量限、检出限等，以确保检测方法的准确性。

1.4 统计学分析 采用SPSS21.0统计软件进行。呈正态分布的计量资料用±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 方法学验证 参照C62-A对自建方法进行方法学验证，在3种基质中维生素K1、MK4、MK7的回收率在90%～115%之间，基质效应在4.96%～5.69%之间，精密度以CV表示，均小于6.25%，检出限和定量限远远小于定量下限，具体结果见表1。

表1 自建方法检验维生素K1、MK4、MK7的方法学考察结果

2.2 不同基质样本K1、MK4、MK7水平 3种不同基质中维生素K1、MK4、MK7的检测结果见表2。3种不同基质中维生素K1、MK4、MK7检测结果差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 3种不同基质中维生素K1、MK4、MK7的检测结果

3 讨论

本研究结果表明，指尖血、血清和血浆3种不同基质用于维生素K1、MK4和MK7含量检测，其结果差异均无统计学意义（P均＞0.05）。指尖血采集比通过静脉穿刺采血更加容易，同时患者对这种形式的采血恐惧心理更小，护理人员的采血压力也更小，但是在采集指尖血时要特别注意，采血中不可用力挤压，以免组织液混入血液，使血液易于凝固和稀释，从而导致测定结果出现误差。

本研究从实际临床需要出发，为医学检验实验室检测维生素K含量提供了参考和依据。必须指出的是，本研究结果可能会受健康志愿者年龄、身体状况、检测方法等诸多因素的影响，本研究征集的30名健康志愿者是年龄在25～45周岁的健康人，采用的是LC-MS/MS方法，因此本研究得出的结论还需要在更多不同人群和其他检测手段中进一步验证。