耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测新方法

董源源

摘要 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）可导致多种感染病。万古霉素是治疗感染的最后药物，随着耐药性不断增加，发现了对万古霉素耐药的菌株。本研究通过大肠杆菌表达系统，表达出具有识别活性的可溶性细胞壁结合域（CBD）蛋白，并偶联磁珠（MBs）作为捕获分子，实现分离。通过裂解细菌获得内部的ATP催化化学反应，收集释放的生物发光（ BL ）信号，定量检测目标细菌。结果表明该方法具有简单、快速诊断MRSA的应用潜力。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;细胞壁结合域;生物发光分析

1. 导论

超级细菌的耐药性使诊断与治疗变得困难，给公共医疗资源带来巨大负担。金黄色葡萄球菌可以引起严重感染，随着耐药性增加，很多常用的抗生素都无法用以治疗[1]，还可能可引发疾病。万古霉素是治疗MRSA最后的药物，但由于存在对其耐药的MRSA菌株，给治疗感染带来了巨大困难。CBD是革兰氏阳性菌内溶素的组成部分，负责识别和结合细菌内保守板块，给予了内溶素的特异性。每个细胞上CBD结合位点高达107个，结合能力与抗体相当。CBD具有更宽的识别谱且成分仅为蛋白质，故具有较高安全保障。本研究表达出CBD结合域，以其为生物捕获探针，利用ATP生物发光技术，建立了一种特异性识别MRSA的新方法，利用ATP提取液可以使MRSA分解，进行在实际样中的应用。

2.实验

2.1仪器：蛋白纯化仪来自GE，化学发光检测仪来自Remax，荧光显微镜来自Nikon Instruments，酶标仪来自Molecular Devices，超声波细胞粉碎机来自SCIENTZ，双系统超低温冰箱来自中科都菱。

2.2实验方法

（1）CBD蛋白的大量表达纯化：预表达后大量表达蛋白，取8 mL过夜菌接种于LB液体培养基中，加IPTG至其最终的浓度为0.5 mM后。离心15 min收集菌体并复溶于PBS 中。加蛋白酶抑制剂使终浓度为1 mM。将混合液置于冰水混合物中超声破菌，离心机在4 ℃下以4000 rmp 离心40 min，上清用0.45 ?m无菌滤器过滤。（2）CBD对MRSA的广谱识别能力测定：取1 mL MRSA菌液，离心3 min后弃去上清并收集沉淀，复溶于PBS中，加入10 ?L GFP-CBD，避光反应30min。再將染色细胞以5000 rmp离心3 min，去除上清，将沉淀复溶于PBS。将制得的成片置于荧光显微镜下，随后在明场和绿色荧光通道下观察。（3）CBD-MBs 的制备：取80 ?L MBs悬浮液置于在磁力架上，用10 mM MES缓冲液洗涤后，将洗涤好的MBs加入到1 mL MES 缓冲液中，于37℃反应1 h后，将MBs重新分散于2 mL CBD溶液中，在4℃下过夜避光反应。将反应完成的反应液PBS洗涤3次，再将偶联完成的CBD-MBs 重新分散于封闭液中，于室温下反应30 min。（4）MRSA的检测：取1 mL的MRSA菌液加60 ?L的CBD-MBs 悬浮液，在37℃下孵育1 h，加入100 ?L ATP提取液反应2 min，再加入100 ?L β-CD（tris-HCl），反应1 min取50 ?L反应液至微孔中，加入发光底液以触发BL信号。

2.3结果与讨论

2.3.1 MRSA的检测的原理：CBD-MBs通过所建立的磁分离技术富集实际样中的MRSA，CBD可以与细菌细胞壁上保守表位结合，形成非共价键与CBD特异性的结合，联用磁性分离方法，迅速富集并分离MRSA。裂解液使细菌裂解，导致ATP释放，释放的ATP与基于萤光素的BL试剂溶液反应，产生强烈的BL信号。

2.3.2 CBD的广谱识别能力：绿色荧光通道下，MRSA菌株表面上均发出强烈的绿色荧光，与明场下细菌的位置可以重叠，但在MSSA菌株上并不能观察到绿色荧光。证明CBD可以广谱识别所有MRSA 菌株类型，并排除来自MSSA菌株干扰，为其临床应用带来可能。

2.3.3 MRSA的检测：用ATP生物发光技术，收集释放的BL，信号范围为1.0×103 CFU mL-1-1.0×107 CFU mL-1，对于低中高浓度MRSA进行相对标准偏差（RSD）分析，其RSD值分别为0.6%，2.1% 和0.1%（n = 3），检测性能表示式：

2.3.4基于CBD检测方法的特异性：选用三种革兰氏阳性菌及三种革兰氏阴性菌，所有待测干扰菌和MRSA的浓度均为1.0×106 CFU mL-1。DI值分别为1.1%、1.2%、1.1%、0.8%、1.3%和1.0%，混合物1为0.3%，包含这6种干扰菌和MRSA的混合液2的BL信号与单独含有MRSA的BL信号强度差异为8%，说明没有干扰，CBD有高度特异性，只能识别MRSA 菌株。干扰度计算方程式：

2.3.5实际样品检测：对尿液与生理盐水样品都进行2种浓度的检测，回收率均在 83.0% - 110.0%间，RSD值均不超过8.6%，故该方法适用于各类样品中MRSA检测。

3. 结论

本研究将CBD作为生物识别试剂，偶联磁分离技术，对目标细菌的快速分离，通过ATP生物发光技术收集释放的BL信号来定量检测，建立了一种快速准确的检测方法，可应用到实际样品检测MRSA 的含量，在实际诊断中有巨大潜力。

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划资助（项目编号：202110635110）

参考文献

[1] Huskins， W. C.; Goldmann， D. A. Controlling meticillin-resistant Staphylococcus aureus， aka “Superbug”. Lancet 2005， 365（9456）， 295-297.2E02E538-F772-4947-BDDE-EE3300E4F93E