复方黄柏液对糖基化内皮细胞增殖迁移成管的影响
2022-06-07陈润铭杜玉青李友山谢存香安琪董学宇
陈润铭 杜玉青 李友山 谢存香 安琪 董学宇
摘要 目的:通過研究复方黄柏液对糖基化内皮细胞增殖迁移成管的影响,寻找复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡的依据。方法:为说明晚期糖基化终产物受体(RAGE),用晚期糖基化终产物(AGEs)诱发内皮细胞功能障碍的重要受体,本研究设置了RT-PCR实验沉默了RAGE,结果发现沉默RAGE后,经AGEs处理内皮细胞,检测其内皮细胞增殖迁移成管作用出现上升,因此检测RAGE表达水平的变化能作为后续评价复方黄柏液改善内皮细胞功能的重要指标。如果RAGE水平出现下降,就证明内皮细胞功能障碍得到了修复,复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡是有效的。为了评估内皮细胞的增殖能力,设置CCK-8实验;用划痕实验检查内皮细胞的迁移水平变化;通过成管实验来测试内皮细胞的成管作用;利用蛋白质印迹法检测RAGE蛋白表达水平。结果:RAGE-3 siRNA沉默效率最好,可用于后续实验。与空白组比较,AGEs处理后内皮细胞增殖活性、迁移水平、成管作用都下降,RAGE蛋白表达水平上升。与AGEs-BSA处理组比较,沉默RAGE或加入复方黄柏液后均较AGEs处理后内皮细胞的增殖迁移成管作用有了提高,RAGE蛋白的表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:复方黄柏液可能通过改善AGEs诱发的内皮细胞功能障碍即促进内皮细胞增殖迁移成管来实现对糖尿病足溃疡的愈合。
关键词 复方黄柏液;内皮细胞;晚期糖基化终产物;糖尿病足溃疡;增殖;迁移;成管
Effect of Compound Fluid of Cortex Phellodendri on Proliferation,Migration,and Tube Formation of Human Endothelial Cells
CHEN Runming,DU Yuqing,LI Youshan,XIE Cunxiang,AN Qi,DONG Xueyu
(Department of Peripheral Blood Vessels,Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China)
Abstract Objective:This study aims to clarify the mechanism of Compound Fluid of Cortex Phellodendri in treating diabetic foot ulcer based on the influence of the prescription on the proliferation,migration,and tube formation of endothelial cells treated with advanced glycation end products(AGEs).Methods:In order to show that receptor for advanced glycation end products(RAGE) is an important receptor for AGEs-induced endothelial cell dysfunction,we performed RT-PCR to confirm the silencing of RAGE.We found that the proliferation,migration,and tube forming ability of endothelial cells treated by AGEs improved after the silencing of RAGE.Therefore,RAGE can serve as important index for evaluating the improvement of endothelial cell function by Compound Fluid of Cortex Phellodendri.If RAGE level dropped,it proved that endothelial cell dysfunction had been alleviated and that Compound Fluid of Cortex Phellodendri was effective for diabetic foot ulcer.Cell counting kit-8(CCK-8) assay was employed to evaluate the proliferation of endothelial cells,scratch assay to check the migration of the cells,and tube forming experiment to test the tube forming ability.Western blotting was used to detect the expression level of RAGE protein.Results:The silencing efficiency of siRNA on RAGE-3 was the highest and thus it was used for subsequent experiments.com
pared with normal control group,AGEs treatment decreased the proliferation activity,migration level,and tube forming ability of endothelial cells and increased the RAGE protein level.com7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F
pared with AGES-BSA treatment group,the proliferation,migration,and tube forming ability of endothelial cells were improved and the expression of RAGE protein was decreased after the addition of Compound Fluid of Cortex Phellodendri or the silencing of RAGE(P<0.05).Conclusion:Compound Fluid of Cortex Phellodendri may improve the dysfunction of endothelial cells induced by AGEs to relieve diabetic foot ulcers.
Keywords Compound Fluid of Cortex Phellodendri; Endothelial cell; AGEs; Diabetic foot ulcers;Proliferation;Migration;Tube formation
中图分类号:R285.5文献标识码:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.006
糖尿病足因机体长期处于高糖状态导致的足部周围神经病变以及如足部感染、溃疡或深层组织破坏等外周血管病变,不仅高发且难愈合。根据最新的糖尿病足治疗指南,我国糖尿病足溃疡的每年发病率为8.1%[1]。因为糖尿病足的高发病率,对其难愈性形成原因的研究越来越受到重视。有研究表明,由于机体长期处于高糖状态导致非酶促糖基化反应产生的终末产物也称晚期糖基化终产物(Advanced Glycation End-products,AGEs),其在体内蓄积,损伤内皮细胞和组织,导致皮肤自身细胞和基质功能不全使糖尿病溃疡难愈合[2]。血管内皮细胞是参与血管生成重要细胞。当组织处于正常状态时,内皮细胞AGEs低表达,但在糖尿病状态下,AGEs与AGEs受体(Receptor for Advanced Glycation End Products,RAGE)水平提高,相关炎症介质也相应被激活,如炎症介质核因子κB(NF-κB)等。已经有研究证实高水平的AGEs会提高炎症的发生概率和破坏内皮细胞,同时也会诱导动脉壁血管收缩功能障碍,最后形成血管局部微循环障碍[3]。因此降低内皮细胞AGEs及RAGE的表达水平,改善AGEs引起的内皮功能障碍,极大可能对由内皮功能障碍引起的难愈性糖尿病足溃疡具有治疗作用。
复方黄柏液是我国骨髓炎专家谢景龙医生总结多年临床经验所得。其对糖尿病溃疡具有显著疗效。王宁等[4]实验证明复方黄柏液对感染抗甲氧西林金黄色葡萄的糖尿病足溃疡疗效好。李友山和杨博华[5]通过外用复方黄柏液和康复新液治疗糖尿病足溃疡疗效对比,发现复方黄柏液对于治疗湿热毒盛型糖尿病足有显著疗效。AGEs是引起血管內皮损伤的重要物质,是糖尿病足的病理基础。而复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡是否与参与改善AGEs诱发的内皮细胞功能仍然未知。本研究基于此前提通过观察复方黄柏液对AGEs处理后内皮细胞增殖迁移成管的影响来探究复方黄柏液与AGEs关系,为复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 内皮细胞(CTCC公司,批号:CL-463)。
1.1.2 药物 复方黄柏液(山东汉方制药,国药准字Z10950097)。
1.1.3 试剂与仪器 EBSS培养基(Hyclone,德国,批号:SH30253.01),FBS(Hyclone,德国,批号:SH30084.03),Trizol提取试剂盒(中国索莱宝公司,批号:R1200),cDNA合成试剂盒(中国生工生物,批号:B532445),AGEs-BSA(BioVision,美国,货号:2221-10),细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8,CCK8)(上海碧云天生物技术有限公司,批号:C0037),Matrigel(BD Incorporated,美国,批号:354248),BCA蛋白定量试剂盒(广州赛国科技公司,批号:BL521A),丽春红S(索莱宝公司,批号:P8330),聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoridepvdf,Pvdf)(Millipore公司,美国,型号:HATF00010)。辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司,批号:ZB2301),辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥公司,批号:ZB2305),RAGE(Abcam,英国,批号:ab3611),GAPDH(Proteintech,美国,批号:60004-1-Ig)。细胞培养箱(Thermo Scientific,美国,型号:8000),酶标检测仪(Thermo Scientific,美国,型号:MK3)低速离心机(上海卢湘仪公司,型号:TDZ4B-WS)。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将设置6个分组。A为空白组,B为AGEs-BSA组(100 μg/mL),C为AGEs-BSA+复方黄柏液1∶100组,D为AGEs-BSA+复方黄柏液1∶200组,E为AGEs-BSA+复方黄柏液1∶400组,F为AGEs-BSA+RAGE siRNA组。
1.2.2 给药方法 当内皮细胞处于对数生长时,调整细胞浓度为2×105个细胞/mL,接种于6孔培养板,每孔2 mL,于37 ℃,5%CO2培养箱内培养24 h。A组仅保留培养基;B组给予100 μg/mL AGEs-BSA处理;C组、D组、E组内皮细胞给予100 μg/mL AGEs-BSA分别与浓度2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL的复方黄柏涂液(即原液1∶100、原液1∶200、原液1∶400)处理;F组内皮细胞给予100 μg/mL AGEs-BSA后与RAGE siRNA处理7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F
1.2.3 检测指标与方法 1)RT-PCR筛选靶向siRNA序列:用Lipofectamine RNAi MAX Reagent与siRNA NC、RAGE-1、RAGE-2、RAGE-3进行转染,培养24 h后收样做RT-PCR。用Trizol提取试剂盒抽提细胞内总RNA;用第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA;以ddH2O、SybrGreen qPCR Master Mix、Forward primer、Reverse primer、cDNA混匀配置Real time-PCR反应液。充分混匀,在以下条件下完成40个循环:94 ℃10 min,(94 ℃20 s,55 ℃20 s,72 ℃20 s)。最后采用2-△△Ct法计算各组RAGE相对表达量。其中实验中用的引物序列为RAGE(human)-RT-F GACCAAGTCCAACTACCG、RAGE(human)-RT-R GCTTCCCTCTGACACACA、Gapdh(human)-RT-R AGGGGCCATCCACAGTCTTC、Gapdh(human)-RT-F AGAAGGCTGGGGCTCATTTG,由上海生工生物工程股份有限公司设计。2)CCK8检测血管内皮增殖情况:将内皮细胞以细胞浓度为5×104 cells/mL接种于每孔100 μL的96孔培养板,于37 ℃,5%CO2培养箱内培养24 h。上述组别给药24 h后,每孔加入20 μL的CCK8,在37 ℃,5%CO2培养箱内避光孵育4 h。最后,使用酶标仪在450 nm处测量吸光度值以测量细胞活力。3)细胞划痕实验:将要用到的器材提前紫外线照射30 min,用marker笔在3.5 cm皿背后划好均匀的横线作标记,将3×105个细胞悬液加入皿中。保证过夜细胞密度达到90%,次日用200 μL枪头尽量垂直于细胞平面沿线划痕。用磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered Saline,PBS)冲洗细胞3次。按照上述分组给药24 h后,用显微镜观察细胞迁移情况并拍照。4)成管实验:融化Matrigel,预冷枪头盒、EP管和96孔板。以每孔50 μL的量将基质胶添加到预冷的96孔板中。将板置于5%CO2,37 ℃的培养箱培养30 min。按照上述分组准备悬液,用胰蛋白酶消化细胞,细胞消化后再将悬液浓度调整为1×105 cell/mL。将以每孔1.0×104个细胞的形式添加到Matrigel包被的96孔板中,并在37 ℃,5%CO2的培养箱中培养24 h。24 h后加入钙黄绿素Calcein AM染色;染色30 min后于荧光显微镜下观察拍照。5)蛋白质印迹法实验:按照上述分组给药24 h后,用RIPA裂解细胞,并加入适量的PMSF,置于冰上裂解、离心后弃上清提取细胞总蛋白。绘制标准曲线得到各组蛋白含量,根据蛋白定量结果上样、聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulate(SDS)-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)、转移到PVDF膜。用丽春红染色检测转膜是否成功。封膜及孵育抗体、显色拍照。
1.3 统计学方法 用SPSS 16.0进行数据分析,以均数±标准差(±s)表示所有数据,2组间比较采用t检验,多组间数据比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 siRNA序列筛选结果 RAGE-3 siRNA沉默效率最高,RT-PCR结果显示,与空白组比较,RAGE-1 siRNA,RAGE-2 siRNA,RAGE-3 siRNA 3条siRNA转染细胞后,RAGE的表达均有不同程度的下降(均P<0.01),其中RAGE-3 siRNA的RAGE表达较其他组最少,因此后续实验选用RAGE-3 siRNA。见表1。
2.2 复方黄柏液能促进AGEs处理后内皮细胞增殖
根据测得的A值分析细胞活性状况:与空白组比较,AGEs-BSA细胞活力明显下降。而使用复方黄柏液的组较AGEs-BSA组细胞活力有提高(P<0.05);但复方黄柏液浓度较低的2组差异无统计学意义(P>0.05)。与AGEs-BSA组比较,作为AGEs的受体RAGE,将其沉默后,细胞活力有提高(P<0.05)。见表2。
2.3 复方黄柏液促进AGEs处理后细胞迁移
各分组迁移情况在显微镜下观察,与空白组比较,AGEs-BSA组细胞迁移率明显下降(P<0.01)。与AGEs-BSA组比较,加入复方黄柏液或将AGEs的受体RAGE沉默后,细胞迁移水平较之有提高(P<0.05);但在这种差异仅在复方黄柏液浓度最高的一组才有体现。见图1,表3。
2.4 复方黄柏液促进AGEs处理后细胞成管作用 与空白组比较,AGEs-BSA成管作用减弱(P<0.01)。与AGEs-BSA组比较,加入复方黄柏液或沉默AGEs的受体RAGE,细胞成管作用增强(P<0.05,P<0.01);但复方黄柏液浓度最低的一组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2,表4。
2.5 复方黄柏液使RAGE的蛋白表达下降
与空白组比较,AGEs-BSA组的RAGE的蛋白表达上升(P<0.01)。与AGEs-BSA组比较,加入复方黄柏液或将RAGE基因沉默后,RAGE的蛋白表达下降(P<0.05)。见图3,表5。
3 讨论
糖尿病足溃疡难愈合一直是治疗难题。目前主要治疗方法是负压闭式引流、清创术、截肢手术等,但费用高昂,有的必须住院治疗,有严格的适应证等缺点。中医药治疗糖尿病足溃疡有着独特的经验,其中的外治法是其核心所在。塌渍法是最常用来治疗糖尿病足的外治法,而复方黄柏液是目前临床上最常被用来塌渍治疗糖尿病足溃疡的外用试剂。复方黄柏液是一种中药复方溶液,内含黄柏、金银花、连翘、蒲公英、蜈蚣,能够清热解毒,外用则能治疗阳性疮疡,能够明显缓解由热毒郁积所致红肿热痛的症状。其中蜈蚣擅长钻缝穿隙,取蜈蚣爬行之性,在人体运用内可通行脏腑,外可达经络,可以治疗一切疮疡肿毒[6]。諸药合用,药少力专,适用于热毒炽盛,热盛肉腐的阳性疮疡破溃期。糖尿病本因机体阴虚燥热而成,糖尿病血糖控制不佳说明此时体内长期处于阴虚内热,日久伤气,气虚则无力运血形成血瘀,瘀久化热,热盛肉腐,发于足部肌肉,则为糖尿病足溃疡。临床多运用复方黄柏液湿敷创面治疗糖尿病足溃疡,这样药液能够直接进入热毒聚集破溃的创面,具有清热解毒消肿,通络止痛的功效。徐炯[7]以复方黄柏液作为观察组,生理盐水作为对照组,观察二者对糖尿病足溃疡的影响,证实了复方黄柏液具有改善患者糖尿病足溃疡状况的作用。马红霞和殷元万[8]以复方黄柏液作为观察组,康复新液作为对照组治疗糖尿病足溃疡,复方黄柏液疗效明显优于康复新液。现代医学在糖尿病足中发现了铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等菌群,认为可以通过抑制病原菌来治疗糖尿病足溃疡[9]。而复方黄柏液也被发现具有明显抑制这些细菌生长的作用[10]。但目前复方黄柏液对糖尿病足溃疡的具体作用机制仍未知。7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F
糖尿病足溃疡一旦无法控制有极大可能发生截肢,目前认为糖尿病足溃疡难愈合可能与AGEs、内皮细胞相关。当人体长期处于高糖状态,体内的蛋白质与还原糖、脂质等物质会发生非酶促反应而产生AGEs。血管内皮细胞是高血糖损伤的主要细胞。内皮细胞损伤后会出现血管通透性提高、细胞体积增大、血管破裂出血、管腔狭窄闭塞导致组织血流量减少,最终组织会出现缺血坏死引发糖尿病微血管病变。因此内皮细胞的改变是糖尿病足早期病变的病理基础[11]。除此之外,内皮细胞还是血管新生的关键细胞,能够参与血管的再生过程。血管生成是由多道程序组成的,它囊括了血管内皮细胞的增殖、迁移、成管以及毛细血管发芽等[12-13]。高浓度的AGEs会引发内皮细胞的紊乱[14]。Li等[15]认为AGEs通过协调内皮细胞中的ARHGAP18/RhoA信号通路来激活核因子κB信号通路,影响VE-钙黏蛋白和紧密连接蛋白的结构和形态,引起内皮细胞皱缩,内皮细胞通透性增加,最后破坏内皮细胞的活性。邸铁涛等[16]认为AGEs能导致血管内皮生长因子的减少,使溃疡中血管再生困难。Ando等[17]的研究表明AGE-RAGE介导的活性氧的产生导致一氧化氮的减少,而一氧化氮不仅会抑制血管壁细胞中的炎症增殖反应,而且还会在体内发挥抗血栓形成和内皮细胞的保护特性。因此一氧化氮减少会带来内皮细胞功能障碍。Adamopoulos等[18]认为AGE可以影响细胞外基质组分的结构和功能,并通过与RAGE结合诱导内皮细胞激活了促丝裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)。随后,炎症介质核因子κB被激活,导致促炎症和氧化应激介质的上调,最终导致内皮细胞失去稳态,产生有害的血管效应。活化蛋白-1(Activating Protein-1,AP-1)转录因子也可通过AGE/RAGE/MAPK信号轴被激活,并与核因子κB协同诱导促炎基因的表达。综上所述,AGEs能够通过多途径、多方面来破坏内皮细胞组分,使内皮细胞的凋亡加快,最终使血管再生困难,是糖尿病足难以愈合的关键因素。
AGEs-BSA是AGEs的理想模型,因为人血白蛋白与牛血清白蛋白具有高度同源性的氨基酸序列,且价格较低制备方便[19]。根据信号转导途径分类,有3种受体能够识别AGEs与其结合,分别是由(a)AGE-R1 80K-H,AGE-R2 OST-48和AGE-R3 galectin-3组成的AGE-R復合物,(b)RAGE和(c)CD36属于SR-B(巨噬细胞清除剂受体型B)。而RAGE主要表达于血管与内皮细胞,可用于研究AGEs与内皮细胞之间的关系,因此主要讨论RAGE[20]。除此之外,AGEs主要通过与其受体RAGE结合来损伤细胞[21],为了阐明AGEs与受体RAGE结合对细胞的损伤,我们特意利用siRNA沉默受体RAGE的表达。结果表明,AGEs能降低内皮细胞的增殖、迁移、成管作用,而加入复方黄柏液或沉默受体RAGE后,原本降低的增殖、迁移、成管作用有了提高,但实验中也发现低浓度的复方黄柏液,如实验中的1∶200、1∶400,相对AGEs-BSA组差异没有统计学意义(P>0.05)。这可能也说明了复方黄柏液要发挥治疗糖尿病足溃疡的作用可能还需要一定的药物浓度。总之,复方黄柏液能改善糖尿病足AGEs的蓄积,对治疗糖尿病足溃疡有一定疗效。此外,我们还通过蛋白质印迹法实验印证了复方黄柏液对RAGE的影响,结果显示RAGE表达出现下降,这也说明复方黄柏液能够通过降低RAGE表达,阻断AGEs与受体RAGE结合,减少AGEs对机体的损伤。
综上所述,糖尿病足患者由于身体长期处于高糖状态导致AGEs的蓄积,而AGEs的积蓄破坏了在血管新生发挥重要作用的内皮细胞,最终导致了糖尿病足的难愈合。实验中复方黄柏液能够改善AGEs处理后内皮细胞增殖迁移成管作用,说明它能够减轻AGEs诱导的内皮功能障碍,发挥促进糖尿病足溃疡愈合的作用。
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(2021-03-28收稿 本文编辑:张乐杰)
基金项目:国家自然科学基金面上项目(81973849-H2709)作者简介:陈润铭(1995.08—),女,硕士生研究生在读,研究方向:中医外科周围血管,E-mail:chenrm95@163.com
通信作者:李友山(1979.10—),男,博士,主任医师,博士研究生导师,研究方向:中医外科周围血管,E-mail:lys4626@sina.com7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F