参草通脉复方对慢性心力衰竭模型大鼠心肌重构及心肾功能的影响研究

礼海，刘晓蕾，王懿，张艳

研究显示，慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）患者占同期心血管疾病住院患者的20%［1］。受冠心病、心肌梗死等疾病的影响，我国CHF年发病人数在50万以上，并呈递增趋势［2］。CHF患者的治疗多以药物干预为主，但部分治疗方案因价格昂贵无法推广［3］。而长期使用强心、利尿等口服药物，不良反应明显。经过十余年的临床经验摸索，本团队研发了可活血化瘀、益气通络的参草通脉复方，临床反馈其对CHF患者具有较好的临床疗效［4］。为明确作用靶点，本研究分析参草通脉复方对CHF模型大鼠心肌重构及心肾功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验时间 本实验时间为2019年9月至2020年2月。

1.2 实验动物 SPF级12周龄体质量为300～350 g的雄性大鼠50只，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。许可证号：SCXK（辽）2015-0001，合格证号：201703120，本研究经辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准。饲养条件：敷料每3 d更换1次，更换期间对饲养环境进行紫外线消毒；每日更换水瓶，湿度保持在40%～60%。

1.3 实验药物 参照文献［4］和《中华人民共和国药典（2015年版）（一部）》［5］选取药材，然后由辽宁中医药大学附属医院生产参草通脉复方（药物基本成分为黄芪、丹参、益母草、人参、红花、三七粉、葶苈子；配伍比例为3∶2∶2∶1∶1∶1∶1，辽药制Z0901013）。福辛普利钠片（国药准字H19980197）由中美上海施贵宝制药有限公司生产。

1.4 主要试剂及仪器 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，全自动生化分析仪购自南京贝登医疗股份有限公司。

1.5 实验方法

1.5.1 实验分组及干预方法 将50只大鼠适应性喂养7 d，编号后采用随机数字表法将其分为正常组、假手术组、模型组、中药组、西药组，各10只。正常组不进行手术；假手术组、模型组、中药组、西药组大鼠禁食不禁水12 h后，采用10%水合氯醛以0.5 ml/100 g的剂量进行腹腔麻醉，对大鼠行气管插管术，并迅速连接小动物呼吸机（通气频率80次/min，潮气量0.7 ml/kg），在左侧第三、四肋间横向切开长度为1～2 cm的开口，逐层钝性分离，暴露心脏，于左冠状动脉前降支起源点3～4 mm处缝线结扎（假手术组结扎5 s后松开），心电监测显示胸前导联ST段及T波明显异常，重置心脏于胸腔，分层缝合，开口处敷注射用青霉素钠，待大鼠平稳后进行口腔清痰，停呼吸机。术后72 h内给予注射用青霉素钠30万U·次-1·d-1。术后常规喂养7 d。模型组、中药组、西药组术后第8天将饲料减少1/3，每天进行1次游泳训练至大鼠疲乏，第14天开始改为1次/3 d；共训练28 d。建模成功标准：多普勒超声心动图检测显示左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）≤60%［6］。建模成功后，中药组、西药组大鼠按人鼠剂量换算公式〔剂量（g/kg）=给出人的剂量（g）×系数（0.018）/所求动物体质量（kg）〕灌胃给药［6］，其中中药组给予参草通脉复方生药7.2 g·kg-1·d-1，2次/d；西药组给予福辛普利和蒸馏水，首次为福辛普利1.2 mg/kg，第2次为蒸馏水1.5 ml。正常组、假手术组、模型组大鼠给予蒸馏水灌胃，1.5 ml/次，2次/d。共干预28 d。

1.5.2 免疫组化法检测大鼠心肌组织基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9、血管紧张素Ⅱ-1型受体（angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R）表达水平 干预结束后各组大鼠禁食不禁水12 h，采血后麻醉并处死所有大鼠，取心肌组织（每只大鼠取100 mg）于液氮-80 ℃条件下保存。取各组大鼠心肌组织，采用多聚甲醛固定50 min，PBS洗涤2次、2 min/次；5 ℃下脱水，常规石蜡包埋，切片（4 μm），置于经多聚赖氨酸处理后的载玻片上，在60～610 ℃烤箱中放置60 min；PBS洗涤2次、5 min/次；置于0.3%过氧化氢中5～10 min，再用蒸馏水洗3次、2 min/次；浸入枸橼酸中，加热至沸腾，间隔10 min后反复1次，冷却后用PBS洗涤2次、1 min/次，静置5 min，PBS再洗涤2次、1 min/次；加入5% BSA静置20 min，于37 ℃下加一抗，1 h后用PBS洗涤2次、1 min/次；加二抗于37 ℃下孵育20 min，用PBS洗涤4次、5 min/次；将其置于免疫组化试剂盒中，加入ABC试剂于37 ℃下孵育30 min，脱水、封固，利用Image-Pro Plus图像软件分析MMP-9、AT1R表达水平。

1.5.3 酶联免疫吸附试验检测大鼠内生肌酐清除率（creatinine clearance，Ccr）、B型利钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）水平 分别于干预前、干预后采集各组大鼠目内眦静脉血1 ml，3 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），取上清液，于-20 ℃下保存。利用全自动生化分析仪、采用酶联免疫吸附试验检测Ccr、BNP水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，组内比较采用配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌组织MMP-9、AT1R表达水平 干预后各组大鼠心肌组织MMP-9、AT1R表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。假手术组、模型组大鼠心肌组织MMP-9、AT1R表达水平高于正常组，西药组大鼠心肌组织AT1R表达水平高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠心肌组织MMP-9、AT1R表达水平高于假手术组、中药组、西药组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组大鼠心肌组织AT1R表达水平低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

表1 各组大鼠干预后心肌组织MMP-9、AT1R表达水平比较（±s，n=10）Table 1 Comparison of expression levels of MMP-9 and AT1R in myocardial tissue of rats in each group after intervention

表1 各组大鼠干预后心肌组织MMP-9、AT1R表达水平比较（±s，n=10）Table 1 Comparison of expression levels of MMP-9 and AT1R in myocardial tissue of rats in each group after intervention

注：a表示与正常组比较，P＜0.05；b表示与假手术组比较，P＜0.05；c表示与模型组比较，P＜0.05；MMP=基质金属蛋白酶，AT1R=血管紧张素Ⅱ-1型受体

组别 MMP-9 AT1R正常组 98.26±27.83 138.88±16.51假手术组 174.28±39.01a 231.23±33.51a模型组 527.92±83.16ab 311.51±41.06ab中药组 121.76±18.96c 178.28±30.50bc西药组 127.32±21.40c 199.84±34.70ac F值 161.352 40.509 P值 ＜0.001 ＜0.001

图1 免疫组化法检测各组大鼠心肌组织MMP-9、AT1R表达水平（×40）Figure 1 Expression levels of MMP-9 and AT1R in myocardial tissue of rats detected by immunohistochemistry in each group

2.2 Ccr、BNP水平 各组大鼠干预前、干预后Ccr、BNP水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。假手术组、模型组、中药组、西药组大鼠干预前Ccr、BNP水平高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；假手术组大鼠干预后BNP水平高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、中药组、西药组大鼠干预后Ccr、BNP水平高于正常组、假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组、西药组大鼠干预后Ccr、BNP水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；西药组大鼠干预后Ccr、BNP水平高于中药组，差异有统计学意义（P＜0.05）。假手术组、中药组、西药组大鼠干预后Ccr、BNP水平分别低于本组干预前，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠干预后BNP水平高于本组干预前，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠干预前后Ccr、BNP水平比较（±s，n=10）Table 2 Comparison of Ccr and BNP levels of rats in each group before and after intervention

表2 各组大鼠干预前后Ccr、BNP水平比较（±s，n=10）Table 2 Comparison of Ccr and BNP levels of rats in each group before and after intervention

注：a表示与正常组比较，P＜0.05；b表示与假手术组比较，P＜0.05；c表示与模型组比较，P＜0.05；d表示与中药组比较，P＜0.05；e表示与本组干预前比较，P＜0.05；Ccr=内生肌酐清除率，BNP=B型利钠肽

组别 Ccr（ml/min） BNP（pg/ml）干预前 干预后 干预前 干预后正常组 6.17±0.68 6.32±0.72 63.06±6.33 65.32±5.85假手术组 16.77±2.57a 6.53±0.89e 900.89±84.68a 499.86±37.69ae模型组 16.49±2.41a 18.30±1.67ab 983.48±95.70a 1 105.73±69.39abe中药组 17.02±2.40a 9.30±0.85abce 988.62±97.34a 581.35±55.70abce西药组 16.93±2.51a 12.47±1.06abcde 973.54±95.41a 659.66±63.73abcde F值 45.356 209.167 232.844 515.480 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

报道显示，CHF患者5年生存率＜40%，CHF严重威胁人类健康，并占用大量医疗资源［7］。心脏再同步化治疗、左心室辅助装置等多因价格昂贵等原因无法在临床广泛应用，因而CHF患者多是长期使用药物治疗，而利尿剂、洋地黄类药物随着使用时间的延长患者不良反应越明显，造成患者依从性差。因此，本研究组从中医药入手，结合多年临床经验，研发出高效低毒的中药复方——参草通脉复方［4］。本研究旨在分析参草通脉复方对CHF模型大鼠心肌重构及心肾功能的影响。

实验发现，心肌重构过程中心肌细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成发生改变，其Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量减少，导致其不能有效起到骨架支撑的作用［1］。而MMP是降解胶原蛋白的重要物质，可维持现有心肌结构，适度调节新陈代谢，以保证心肌正常结构与功能。当心排血量减少后，心肌做功增加，导致心肌细胞过度拉伸，加速心肌老化，MMP被大量激活，导致心肌胶原蛋白降解增加，加速心肌结构发生变化，进而导致心肌重构，其中MMP-9是降解心肌胶原的主要物质。前期研究发现，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）在正常状态下通过释放血管紧张素调节血管收缩，维持正性肌力，分泌醛固酮［6］。而在心排血量减少、心脑肾等长期处于低灌注状态时，RAAS会过度释放肾素，前期可维持正常灌注，但长期可导致血管调节失常，引发血流动力学异常。失代偿后RAAS不断释放血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ），当AngⅡ作用于心肌细胞的AT1R时，能够引起血管平滑肌收缩，增加心室前后负荷，引发心肌超负荷，导致心肌重构［7］。因此，MMP-9、AT1R表达水平可反映心肌重构情况［8-9］。本研究结果显示，干预后假手术组、模型组大鼠心肌组织MMP-9、AT1R表达水平高于正常组，西药组大鼠心肌组织AT1R表达水平高于正常组；模型组大鼠心肌组织MMP-9、AT1R表达水平高于假手术组、中药组、西药组；中药组大鼠心肌组织AT1R表达水平低于假手术组；中药组、西药组大鼠心肌组织MMP-9、AT1R表达水平比较无统计学差异；提示福辛普利和参草通脉复方均对改善CHF模型大鼠心肌重构具有积极作用，其可通过降低MMP-9、AT1R表达水平减少对胶原蛋白的分解，降低对心肌结构的破坏；同时通过降低AT1R表达水平，减少AngⅡ的释放，减轻心室前后负荷，从而达到缓解CHF症状的目的。本研究组前期实验发现，参草通脉复方能够有效增加Ⅰ型胶原蛋白表达水平，改善心肌结构，促进心肌细胞AT1R释放Ca2+，减少Ca2+内流导致的兴奋收缩耦联，从而降低血管阻力［10］；参草通脉复方也能够改善ECM组成，提高心肌收缩功能［11］。

CHF患者多伴有不同程度的肾功能不全，且任何药物的长时间使用均会对心肾功能造成不同程度的影响。内生肌酐是机体肌肉肌酸的代谢产物，与血肌酐相比，Ccr可更准确地评价肾功能，且不受其他因素干扰［12］。BNP分布于脑、心脏、肺脏组织，其中以心脏含量最高，其是RAAS的天然拮抗剂，心房负荷过重或扩张时BNP分泌增加，血浆BNP水平升高，其被广泛应用于心功能、心力衰竭严重程度的判定以及心脏病患者预后的分析等领域［13-14］。因此，本研究通过检测各组大鼠心、肾功能指标（Ccr、BNP）来评价参草通脉复方对大鼠心肾功能的影响，结果显示，中药组、西药组大鼠干预后Ccr、BNP表达水平分别低于本组干预前，提示福辛普利和参草通脉复方均可有效降低CHF模型大鼠Ccr、BNP表达水平，从而改善大鼠心肾功能。模型组、中药组、西药组大鼠干预后Ccr、BNP水平高于正常组、假手术组，中药组、西药组大鼠干预后Ccr、BNP水平低于模型组，西药组大鼠干预后Ccr、BNP水平高于中药组，提示与福辛普利相比，参草通脉复方改善CHF模型大鼠心肾功能的效果更好。

参草通脉复方以益气活血、行水为主，其组成中的黄芪主要成分为黄芪皂苷，有明显的强心作用，可减轻缺氧及高负荷条件下的心肌细胞受损程度，通过利尿作用降低心肌负荷，与人参合用有抑制心肌细胞凋亡的作用［13］。而人参的主要成分为人参皂甙，其强心利尿的效果突出，能够增强CHF患者的非特异性免疫能力［14］。丹参中丹参酮的各分型均有扩张血管、降低心肌负荷、增加心脑肾供血的作用，其抗缺氧、抗氧化作用明显，有修复心肌细胞、保护心肾等脏器的作用［15］。益母草利水消肿，其主要成分益母草碱在明显增加冠状动脉血流量、降低冠状动脉阻力的同时，能够有效降低心率、减少氧自由基对心肌的损伤［16］。红花中的红花苷与红花黄色素能够增加冠状动脉与肾脏血流量，改善心肌缺血状态，双向调节心率，减轻炎症反应，保护心肾血管［17］。三七粉中的三七总皂苷具有强心、扩血管的作用，兼具抗动脉粥样硬化、降低血小板活性、抗血栓形成的作用，可有效保护心、脑、肾等器官［18-19］。葶苈子的主要成分为葶苈苷、糖芥苷，其有明显的强心、降低心率的作用，可促进排尿及调节肾脏代谢［20-22］。全方合用可强心、利尿，从而保护肾功能，兼有抗氧化、抗炎等功效。

综上所述，参草通脉复方能够通过降低CHF模型大鼠心肌组织MMP-9、AT1R表达水平来抑制其心肌重构进程，且与福辛普利相比，参草通脉复方可更有效地改善大鼠的心肾功能，这为CHF中药新药的研发提供了数据支持与科学依据。但本研究样本量较小，且观察指标不够全面，需要进一步扩大样本量、增加观察指标来进一步验证本研究结论。

作者贡献：礼海进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析，撰写、修订论文；刘晓蕾、王懿进行数据收集与整理、统计学处理、结果的分析与解释、英文的修订；张艳负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。